一．饱和浓度法计算EC50值

采用饱和浓度法（R代表受体或抗原，L代表配体或抗体），如果要测定配体相对于受体的亲和力，少量R存在的情况下，将L进行梯度稀释，检测R-L复合物的浓度，当R-L复合物的浓度占总R浓度的一半时，L对应的浓度值（EC50）即L相对于R的KD值。RL复合物/R即B值可用检测的信号值代替，梯度稀释的L和信号之间的函数关系满足下面的公式，只有在此在特定的实验条件下EC50值能够等价于KD值。

饱和浓度法测定KD值有几个关键点，即相互作用的两个分子，R要少量，L要进行连续的梯度稀释，需要得到的信号响应值（所有的R的结合位点被L占据）即平台期，那么在此条件下，占据一半R时，所需要的L浓度（EC50）为KD值。

二．抗体EC50测定步骤

1. 选择合适的抗原：根据研究目的选择与抗体结合的特定抗原。

2. 选择合适的实验体系：可以选择细胞表面表达抗原或合成的抗原等。

3. 制备抗原溶液：按照一定浓度序列制备一系列抗原溶液。

4. 操作平台设置：使用业的生物技术设备和软件进行实验设置。

5. 抗体与抗原结合：将抗体与抗原溶液进行反应，一定时间后使其达到平衡状态。

6. 反应终止与分离：通过适当的方法终止反应，并将未结合的抗体与抗原分离。

7. 信号检测：使用合适的检测方法，如酶联免疫吸附实验（ELISA）等，测定已结合的抗体数量。

8. 数据分析：根据实验结果绘制曲线并计算出EC50。

三．抗体亲和力检测注意事项

1. 标准的剂量曲线拟合一般用四参数拟合，需要有明显的上下平台期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之间，EC50（C值）即为抗体相对于抗原的亲和力值。

2. 酶联抗体效应过量，酶联抗体的稀释需要做不同的稀释度进行比较选择，对于单抗成分的酶联抗体，如果高低两个稀释度的酶联抗体能够产生一样的剂量曲线，说明酶联抗体过量，ELISA的信号传递未产生偏差。对于多抗成分的酶联抗体，其稀释度的判断较为复杂，可以初略计算下酶联抗体的摩尔浓度要高于包被上的抗原摩尔浓度的5倍以上。当酶联抗体浓度较小时，酶联抗体在高剂量不同浓度的抗体条件下均被抓到，曲线有假上平台。

3. 如果需要减少反应过程中高浓度的抗体（100000ng/ml）对酶标板材的非特异吸附，在包被过程中，建议选择疏水性酶标板材（polysorp），包被的抗原浓度需要少量0.2-1ug/ml，具体情况需要根据抗原抗体的亲和力大小来进行判断优化。一般来说亲和力越强，所需的抗原包被浓度越低。

4. 对于吸光度值底物和荧光底物，仪器检测的信号值和显色时间成正比，控制在10-30分钟为宜。需要提确认检测仪器的信号线性范围，比如一般的酶标仪吸光度值的信号线性范围在0-3，吸光度值在3-4之间为非线性的，在显色时应控制信号值不要超过3，当信号值超过线性范围时，曲线有假上平台。

泰克生物亲和力检测研究，能够给客户提供业、有效的售技术咨询和准确的数据支撑，为客户的实验项目提供强有力的保障。目，常用的检测亲和力的方法有很多，但其中大多数要么依赖昂贵的设备（表面等离子体共振），要么不普遍适用（荧光修饰、透析）或者需要修饰的抗原（放射性沉淀标记的抗原）。而竞争ELISA法测定亲和力则是例外，它仅依赖于少量纯化抗原和抗体即可进行亲和力的检测。

原创作者：泰克生物科技（天津）有限公司