人细胞角蛋白18-M65(CK18-M65)ELISA试剂盒技术进展和发展趋势

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 上海齐态生物科技有限公司

样品收集、处理及保存方法

1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3. 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

5. 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂盒操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

ELISA试剂盒检测过程中的注意事项

1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但好有业人员进行矫正。

2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。

3、要在实验1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

4、实验时，要使底物避光保存。

5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

6、浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，终结果乘以5才是样本实际浓度。

7、严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

注意事项

1．试剂盒使用请保存在2-8℃。除复溶后的标准品，其他成分不可冻结； 

2．浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用请用手甩几下或1000rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底；

3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，使结晶完全溶解后再配制洗涤液；

4．实验过程中，冻干标准品为一次性使用，不得分装。因其浓度较低，溶解两小时候后，会迅速失活；

5．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用；

6．配制试剂时，要用旋涡混合仪混匀。加入孔内的试剂，充分混匀对测试结果尤为重要，好使用微量振荡器(使用低频率)，如无微量振荡器，可在反应手工轻轻晃动酶标板1分钟，例如做圆周动作，使加入孔中的反应液混匀；

7．实验用酶标仪应严格按使用说明书规范操作，并在使用充分预热；

8．ELISA实验中标准品和样本检测时建议作复孔； 

9．应将未用的酶标板放回原铝箔袋中，置2-8℃保存；

10．显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；

11．超过使用有效日期的试剂盒不能应用于实验中；

12．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，波长应该设置为450nm和630nm；

13．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按生物废弃物处理。终止液为2M硫酸，使用时必须注意安全；

14．各步骤加样均应使用加样器，并经常校准其准确性，以避免试验误差。一次加样时间好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样；

15．每次试验测定的同时做标准曲线，好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔高浓度的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n）；

16．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性；

17．以洗板机洗板时,每孔注液量不应少于350μl, 注意检查加样头是否堵塞。手工洗板时, 用带纸屑的吸水材料应慎重, 防止外源性过氧化物酶类似物或氧化还原物与显色剂发生反应；

18．用终止液终止反应后，请于10分钟内读取OD值；

19．进行复孔实验时，结果计算一定要求平均值；

20．标本溶血可能会有假阳性结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；

21．实验时，应该将加过样品的板条放于密闭盒内，并保持湿度约60%左右；

22．为保证恒温箱内的温度为37℃，恒温箱的温度要经常校准。以确保实验温度保持恒定； 
试剂盒组成

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