介绍

每年，约有280，000名患者接受机械或生物假体心脏瓣膜移植。20 虽然这些是救生设备，但这些假肢缺乏生长潜力是儿科患者的一个主要问题。他们必须经历多次分阶段的干预，以适应增加的环空尺寸，并增加发病率和死亡风险。22 因此，迫切需要具有持续一生的生长能力的心脏瓣膜假体。3，21

去细胞化组织工程心脏瓣膜 （DTEHV） 可能是一种有途的替代方案。从我们的个长期体内实验中，我们将DTEHV植入绵羊和非人类灵长类动物中，我们了解到DTEHV在5小时后开始重新填充，伴随着植入8周后细胞外基质的变化。此外，随着时间的推移，ECM的产生表明组织再生和生长潜力。6，30 这与去细胞化的异源性心脏瓣膜相反，后者仅显示有限的宿主细胞再填充。7，13 此外，这些DTEHV可以现成提供。5 虽然这些结果很有希望，但有小叶缩短和小叶与壁融合的迹象，终导致瓣膜功能不全，其他组也报告了这种效果。8，10 关于这个传单引信和缩短问题的解释可以在阀门几何形状中找到。从Loerakker等人15的计算模拟中可以看出，当在生理肺压下加载时，这种原始瓣膜设计中的小叶在径向方向上受到组织压缩。这也许可以解释为什么这种特殊的瓣膜几何形状与浸润的宿主细胞诱导的重塑相结合，终导致小叶尺寸减小。基于这些发现，Loerakker等人还提出了一种改进的瓣膜几何形状，该几何形状应该能够在血液动力学加载期间径向小叶延伸，以抵消细胞缩回力。这需要更深的腹部曲率，增强的凝固区域以及主要是圆周胶原取向。15 然而，迄为止，在培养过程中控制组织工程心脏瓣膜（TEHV）的几何形状是有限的。无论支架起始基质的初始形状如何，组织压实发生在所有可能的无约束方向上，以响应用于培养瓣膜的血管衍生细胞（肌成纤维细胞）施加的牵引力。29 这导致小叶结构扁平，培养后无共适配区。12，17

因此，本研究的目的是找到一种解决方案，以便能够根据计算模拟中建议的几何形状改进，施加和维护DTEHV几何形状，以减少肺负荷条件下径向方向的小叶组织压缩。开发了一种与改进的几何形状相匹配的生物反应器插入物，它将在培养过程中作为整体几何约束。通过这种方式，小叶将在生物反应器插入物周围压实自己，并且在去细胞化过程后移除插入物时，DTEHV很可能保持其形状。这使得设计、施加和维护所需的 DTEHV 几何形状成为可能。生产了基于人类细胞的DTEHV，并使用流体动力学和疲劳体外测试评估了其功能和稳定性。利用组织学和共聚焦显微镜研究了生物反应器插入物对组织形成和胶原取向的影响。此外，通过力学性质分析，研究组织各向异性程度，并作为计算模拟小叶组织负荷行为的输入，以分析新设计的DTEHV中的径向应变分布。

材料和方法

刀片制造和定位

根据Hamid等人的数学描述，原始阀门设计通过添加配合和增加腹部区域的曲率来改进，如Loerakker等人先所描述的那样。15该改进的几何形状被导出为STEP文件从模拟软件（美国Abaqus 6.10 Simulia）中导出并导入到计算机辅助设计软件中（Autodesk Inventor， 美国），以制造一个长度为27.8 mm，直径为29.7 mm的一体式组件，该组件与舒张压脉冲复印机（DPD）生物反应器系统兼容。17 生物反应器嵌件由一块固体聚醚醚酮（PEEK）利用计算机控制的碾磨技术制成。

插入物位于瓣膜的动脉侧，以便在各个柱子周围进行组织压实。小孔（直径0.5毫米，间距1毫米）覆盖插入壁，以促进与相邻组织的营养交换。顶部有三个大的三角形开口，用于向组织工程瓣膜壁进行介质交换。

心脏瓣膜组织工程

如所述，组织工程心脏瓣膜（TEHV）（n = 5）进行培养。17 简而言之，从无纺布聚乙醇酸网（PGA，厚度1.0毫米，比重70毫克/厘米）切割三叶心脏瓣膜3;塞隆，卢森堡），缝制（Prolene 6-0，美国奥道康）到径向自膨胀镍钛诺支架（长度= 31毫米，ID = 30毫米在37°C;PFM-AG，德国），并涂有1%聚-4-羟基丁酸酯（P4HB;分子量：1 × 106;美国四氢呋喃（THF;西格玛-奥尔德里奇，美国）。心脏瓣膜形状结构的初始坐娆长度为5 mm，大桡骨腹部长度为19 mm。将这些构建体用70%乙醇（EtOH，VWRS.A.S.法国丰特奈苏布瓦）灭菌15分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次10分钟，在抗菌抗真菌溶液中孵育10%青霉素/链霉素（Pen/Strep）（比利时龙沙），用0.5%真菌（美国InvivoGen）洗涤30分钟，并用PBS洗涤3次10分钟。此后，将阀门在生长培养基（美国吉布科高杜贝克科的改性鹰培养基）中孵育过夜，并辅以10%胎牛血清（FBS，德国生物染色），1%笔/链球菌和1%谷氨酶（美国吉布科）。根据荷兰二次使用材料的指南，从一名77岁患者的人类大静脉中收获了主要分离的人血管来源的细胞，并接种（0.3×106细胞/厘米2，通道6）使用纤维蛋白作为细胞载体进入瓣膜形支架。将种子构建体与新开发的插入物一起放入DPD生物反应器系统中，该插入物含有补充L-抗坏血酸2-磷酸（0.25mg / mL，美国西格玛）的生长培养基。脉动流以1 Hz施加到瓣膜的非屏蔽心室侧。

去细胞化程序

体外阀门功能

流体动力脉动功能评估

疲劳评估

组织学

共聚焦显微镜

组织力学和体内胶原蛋白重塑模拟

生物力学分析

使用双轴拉伸试验机（生物测试仪，5 N称重传感器;cellscale，加拿大滑铁卢）与 软件 （V8.01， 细胞标度） 结合使用。两个方形样品 （36 mm2每个）每个瓣膜分别从腹部区域对称切割。使用电子卡尺在3个随机位置测量样品厚度并取平均值。将样品在径向和圆周方向上等双向拉伸，应变率高达20%，应变率为每分钟*。拉伸后，样品以每分钟*的应变速率恢复到0%应变，然后休息循环54。在测量终应力之，用其中5个循环对样品进行预处理。在径向和圆周方向上通过每个单独的数据集拟合高阶多项式曲线。组织的刚度由切向模量表示，并定义为在20%应变下与拟合多项式曲线的切线。

计算模拟

统计学

为了分析DTEHV疲劳行为随时间的变化，对闭合体积，泄漏量，心输出量和有效孔面积进行了线性回归分析（Prism V6.0d，美国Graphpad），p<0.05的斜率显着不为零。对时间点进行平均，并用它们的平均值±标准差来表示。

对于生物力学分析，每个阀门的样品取平均值，并用其平均±标准差表示。各向异性的存在被定义为在径向和圆周方向上获得的刚度之间的显着差异（p < 0.05），使用成对的学生t检验（Prism V6.0d，美国Graphpad）进行分析。

结果

生物反应器嵌件的生产和功能

嵌件的生产

计算仿真所建议的改进的心脏瓣膜几何形状被成功转化为物理刚性物体（图1a），与*相同的几何形状相匹配。嵌件的表面是光滑的，孔均匀分布在整个表面上，以使足够的营养物质交换到支架上。各个柱子之间有足够的空间来防止培养过程中传单融合。插入物很好地安装在DPD生物反应器系统中，而不会阻碍从心室侧流向动脉侧的脉动流（图1b）。

生物反应器插入物和具有代表性的DTEHV结果。开发的生物反应器嵌件，用于在培养过程中施加和控制心脏瓣膜几何形状（a）。以绿色表示的嵌件位置示意图，在生物反应器设置内，心脏瓣膜以红色表示，镍钛诺支架为黑色，脉动介质流动为蓝色箭头（b）。从顶部（c）和底部视图（d）两张使用插入物培养的基于人类细胞的DTEHV的代表性图片，显示大的共置区域和深刻的腹部曲率，与生物反应器插入物的形状相匹配。

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插入件的功能

在培养的4周内，TEHV的小叶紧紧地压实在嵌件周围，以适应施加的几何形状。去细胞化后，瓣膜保持其形状，并且在取出插入物时看不到小叶缩回。配合区域的长度约为5 mm（图1c），DLEV的腹部区域保持施加的曲率（图1d）。组织均匀地分布在整个小叶中，没有任何损伤或其他宏观可检测的不规则性。

血流动力学功能和抗疲劳性

在流体动力学试验装置中，DTEHV（n = 4）经受生理性肺病。一个阀门的代表性图如图2所示。总体而言，所有阀门都*打开（图2 b-2d），并对称关闭（图2 e-2f）。在任何瓣膜中均未观察到脱垂。

生理流体动力学肺体外试验结果。在1200万次循环后，DTEHV经受体外流体动力学生理肺搏动刺激的代表性结果显示功能正常，如图（a）所示。阀门*打开（b–d）并对称地关闭（e，f）。

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对于长期耐久性测定，阀门的打开和关闭行为设置为与流体动力学设置中观察到的生理行为相当。从进行疲劳试验的DTEHV（n = 4）中，三个保持功能，长达约1200万次循环，代表体内随访时间16周。一个阀门在400万次循环中发生故障，并且从一开始就无法在疲劳测试期间保持稳定的压力条件。随着时间的推移，阀门的功能没有下降，初始反流分数为4.13±1.44%，包括关闭体积百分比为3.41±1.42%，泄漏体积百分比仅为0.73±0.08%（图3a）。阀门保持了 2.37 ± 0.04 cm 的一致有效孔口面积2，随着时间的推移，心输出量维持在 4.80 ± 0.11 L/min（图 3b）。功能丧失是突然的，在所有情况下都是传单在其中一个委员会点破裂的结果。

DTEHV 在体外的长期功能行为。从开始（n = 4），300万个周期（n = 4），600万个周期（n = 3），900万个周期（n = 2）和1200万个周期（n = 2）后，反流分数，心输出量和有效孔面积的间隔测量，显示反流随时间没有显着增加（p < 0.05） （a）.此外，心输出量和有效孔口面积也随时间保持稳定（b）。值表示为±标准差的平均值。

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定性组织分析和全局胶原定位

组织学外观

对所有DTEHV的样本进行了组织学检查。图4中的代表性照片表明，组织均匀地分布在整个小叶的厚度中。此外，没有观察到坏死或受损的组织。去细胞化过程成功地去除了所有细胞，如H&E染色所示，尽管组织中仍然存在支架残留物（图4a）。从MTC染色中可以看出，小叶主要由胶原蛋白组成（图4b），在VvG染色中没有弹性基质形成的迹象（图4c），否则黑色纤维会表明这一点。

断续器的组织学。具有苏木精和曙红的DTEHV小叶染色部分的代表性图像，显示适当的去细胞化，相等的组织形成和支架残留物的存在（a）。马森三色主要显示蓝色（b）中描绘的胶原蛋白沉积，其中弹性范吉森表明结构（c）内没有弹性基质形成。

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胶原蛋白定位

通过分析胶原整个支架染色，在5个DTEHV小叶的整个半部分上，在约200μm的深度内可视化了全局胶原取向。Z方向上的代表性大投影如图5a所示。在这里，胶原蛋白在共适应区域（图5b）的圆周方向上清晰地对齐，并且更随机地分布在腹部的底部区域（图5c）。

胶原蛋白定位。通过心室侧共聚焦显微镜观察半个DTEHV小叶上胶原特异性全囊染色的代表性图像，显示胶原方向在凝固区域（b）的圆周方向上清晰对齐，并随机分布到腹部底部（c）。黑点表示焦平面外的局部区域。

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组织力学和体内胶原蛋白重塑模拟

生物力学特性

控制阀的平均拉伸曲线显示，在20%应变下，径向方向的柯西应力范围在200-300 kPa和圆周方向的300-400 kPa之间（图6a），指示组织各向异性。从所有阀门的平均等双向拉伸试验来看，与径向（p = 0.035）相比，圆周方向的切向模量显着更高，分别为3.59±0.95和2.47±20%应变时0.74 MPa（图6b）。

四氢呋喃的机械性能。从对照组的相等双轴拉伸试验中获得的径向和周向应力-应变曲线显示柯西应力范围在200-400 kPa （a）之间。拟合曲线用作计算模拟 （a） 的材料参数。所有DTEHV的计算切向模量显示，与径向相比，圆周方向的组织刚度显着增加（*p = 0.035）（b）。所有值都表示为±标准差的平均值。

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计算模拟

对照组的实验拉伸数据拟合数值模型（图6b），得到以下参数值：\（k_{1}= 2 2. 0\;k_{2} = 7。5 0, \;{\文本{和}} \;\西格玛 = 6 7.5^{{{循环 } .\）

在平均肺压差为15 mmHg时，计算模拟显示，原始设计在加载期间在整个小叶的径向方向上受到小叶组织压缩（图7a）。与原始设计相比，这些DTEHV改进的阀门设计显示出径向组织压缩的显着降低（图7b）。圆周方向的应变在两种设计中都保持了可比性。此外，在改进的设计中，本胶原各向异性对组织负荷的影响显示，与*各向同性的胶原取向相比，桡骨组织压缩没有变化（图7c）。

计算模拟。将DTEHV的材料参数实施到已建立的计算瓣膜模型中，以评估原始和改进的瓣膜设计中径向和周向的应变，模拟15 mmHg的平均肺压。在初的瓣膜设计中，整个小叶组织在径向（a）上被压缩。改进的阀门设计显示腹部径向压缩（b）显着降低，这主要是由于几何改善而不是胶原各向异性（c）。圆周方向的应变在两种阀门设计之间是可比的。

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讨论

从我们次在绵羊中植入DTEHV的长期体内实验开始，我们观察到小叶与壁融合，这导致随着时间的推移瓣膜功能不全的发展。6，30 根据计算模拟，假设必须调整原始的DTEHV几何形状，以便在径向方向上扩展传单，而不是压缩。因此，开发了一种生物反应器插入物，以在培养过程中施加所需的瓣膜几何形状，该几何形状在去细胞化和去除插入物后保持。这导致DTEHV具有增加的配合面积和显着的径向和圆周腹部曲率。

通过引入约束插入物来调整生物反应器系统中的培养条件可能通过限制营养和氧交换而影响了组织的形成。然而，这些DTEHV似乎仍然在整个小叶厚度中含有均匀的ECM分布，主要由胶原蛋白组成。这些组织学发现与先培养的基于人类细胞的TEHV一致，该TEHV具有原始的阀门几何形状，而没有插入物。17

此外，引入插入物会进一步影响全局胶原蛋白的方向。在组织培养过程中，已知无纺布PGA网格会水解，从而失去其机械完整性和结构支撑。9，19，23 这种降解曲线与细胞施加的张力相结合，导致组织在无约束方向上压实，从而导致沿约束方向的胶原取向。4，18

在这项研究中，使用针对刚性物体的组织压实来根据生物反应器插入物的形状施加DTEHV几何形状。培养2周后，支架失去其机械完整性，组织开始致密。29 在压实时，小叶组织受到刚性生物反应器插入物的约束，但小叶游离边缘的组织在径向方向上仍可能略微压实。这导致在凝固区域主要是圆周对齐的胶原蛋白，并且更随机地分布在腹部底部。

其他使用约束方法来控制DTEHV几何形状的研究很有希望，但是到目为止还没有报道高达1200万次循环的长期功能。18，24–26，28 本研究中产生的DTEHV在反流、心输出量和打开和关闭行为方面显示出长达16周的体内模拟的令人满意的长期功能，只有一个瓣膜在400万次循环后失效，无法在疲劳测试期间适应和稳定施加的肺压条件。从先在绵羊和非人灵长类动物中的体内植入研究中，在5小时内观察到宿主细胞再繁殖，伴有8周后细胞外基质的变化，并有证据表明这些细胞产生ECM。6，30 因此，本研究中开发的DTEHV在生理性肺条件下应具有足够的抗疲劳性，以便为宿主细胞重新填充和维持ECM提供足够的时间。

除了在大的共置面积和增强的腹部曲率方面改善瓣膜几何形状外，胶原各向异性对于在动态加载期间获得径向小叶拉伸至关重要，这是天然小叶的特征，2由于菌株诱导的胶原重组而导致体内植入后的各向异性进一步增加。4 与报告的刚度值相比，1人本体主动脉瓣瓣小叶在径向和周向的切向模量分别为约2.0±1.5和15.6±6.4 MPa。报告的径向DTEHV的切向模量与2.5±0.7 MPa相当，但在圆周方向上较低，为3.6±1.0 MPa。

尽管局部观察到的胶原各向异性差异没有实现到模型中，但这些计算模拟表明，整体胶原各向异性的额外效应似乎不会影响肺负荷条件下的组织负荷行为。因此，仅实施的几何改进就足以防止整个瓣膜几乎*受到径向组织压迫。

使用DTEHV进行人类应用的概念在再生能力和增长潜力方面仍然有很大的希望，这将克服对年轻患者进行多次再干预的必要性。不需要使用自体细胞，可以使用异体细胞来简化法规并允许现成的可用性。进一步开发适用于微创心脏瓣膜植入的生物降解支架应成为未来研究的重点，以完成生长瓣膜概念。

总之，本研究提出了一种成功的解决方案，通过在培养过程中使用约束性生物反应器插入物来施加所需的三维弯曲组织工程瓣膜几何形状，从而允许在去细胞化和去除插入片段后保持形状。这导致了*有能力的现成的基于人类细胞的DTEHV，具有较大的共置面积和深刻的腹部曲率。长期功能主要维持长达16周的体内模拟，为宿主细胞的再繁殖留出了足够的时间。使用生物反应器插入物导致均匀分布的组织形成，共适区域的圆周胶原取向以及整个小叶组织各向异性。基于力学数据，我们的计算模型显示，通过获得的几何调整，桡骨组织压缩显著降低。因此，这些改善的DTEHV预计不易发生宿主细胞介导的小叶缩回，并且在植入后仍将保持能力。