革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒

EX1220 革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒

格：10T
英文名称: Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Maxi Kit
储存条件: RNA酶，溶菌酶于-20 ℃保存，其它试剂室温保存。复检期一年

EX1220 革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒

注意：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入），混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

操作步骤（仅供参考）：

1. 取50-200ml 细菌培养物，11000rpm离心5min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml 溶液Ⅰ和1ml 溶菌酶，混匀。37℃水浴30 min 以上（根据菌液量可适当加长水浴时间，请先检查溶液Ⅰ是否已加入 RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器che底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未che底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3. 向离心管中加入 5ml 溶液Ⅱ，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。

4. 向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10 min ，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5. 将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，11000rpm 离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完，可分两次吸附) 。

6. 向吸附柱中加入7ml 漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入7ml 漂洗液，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8. 11000rpm离心5min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR 等。

9. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 1-2ml 经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心2min，收集质粒DNA溶液。

10. （可选）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，11000rpm离心2min。

注意事项：

1. 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

2. 洗脱缓冲液体积不应少于500ul，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH 值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其 pH值在8.0左右( 可用NaOH 将水的pH值调至此范围) ，pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20 ℃，以防DNA降解。

3. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用400-800ml过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

4. DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰， OD260 值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9 ，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

EX1220 革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒