骆驼外周血单核细胞分离液试剂盒

实验步骤：

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。

1、取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或者肝素抗凝血均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。

2、取一支无菌离心管，先加入试剂A、再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A:试剂D的体积比为3:2，如稀释后的血液样本小于5mL，则先后加入3ml的试剂A和2ml的试剂D；如稀释后的血液样本大于5ml，试剂总量与稀释后的血液样本量相等），两种试剂的分层一定要清晰。

3、将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰（可以使用巴氏德吸管吸取血液，将其小心铺于分离液液面上，因为两者的密度差异，形成明显的分层界面。如果样品较多，加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属于正常现象）。

4、室温，水平转子500-800g，离心20-30min（血液样本的体积月的所需离心力越大，离心时间越长，*佳的离心条件需客户自行摸索，，离心转速不超过1000g）。

5、 离心后将出现明显分层。第 一层为血浆层。第二层为白色单核细胞层。第三层透明试剂D液层。第四层为半透明试剂A液层。第五层为红细胞层（如图）。

6、小心吸取第二层白色单核细胞层到另一无菌的15ml离心管中，加入10ml细胞洗涤液，颠倒混匀，250g，离心10min。

7、 弃上清，5ml细胞洗涤液，清洗液重悬所得细胞，250g，离心10min。

8、 重复步骤7。

9、 弃上清，细胞重悬备用。

10、 差异贴壁法纯化细胞，用单核细胞培养基以10⁶ 个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳细胞培养箱中进行贴壁培养。

1）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。

2）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。

3）不贴壁的为淋巴细胞。

根据不同细胞的贴壁时间存在差异，已达到简单纯化单核细胞的目的，此法成本低，操作简单，如需获得高纯度的目的细胞则需选用免疫磁珠分选或者是应用流式技术分选细胞。

注意事项：

1、开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。

2、分离液使用时自始至终应该保持室温(18-25℃），如室温较低，可将分离液预热。4℃或者尖底温度离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

3、血液样本* 好为新鲜的抗凝血（采血2h以内），为保持单核细胞的红星，应避免冷冻和冷藏。

4、稀释血液或者洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养基，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。

5、部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。

6、血液样本的粘稠度或者温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索*佳的分离条件。

7、吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加；吸取过多的血浆层可能会导致单核细胞中血浆蛋白及血小板污染。

8、如果要进一步对分离的细胞进行培养，在收集血液和分离过程中，注意无菌才做，避免微生物污染。

9、不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。