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细胞培养步骤

1) 培养基及培养冻存条件准备：

1. 准备 McCOY＇s 5A 培养基(McCOY＇s 5A，SIGMA,货号 M4892，添加 NaHC03 2.2g/L)，90%;you质胎牛血清，10%。

2. 培养条件：气相：空气，95%;二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3. 冻存液：90%完全培养基，10%DMSO,现用现配。液氮储存。

2) 细胞处理：

复苏细胞：将含有 lmL 细胞悬液的冻存管在 37°C 水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 4分钟，弃去上清液，补 加 l-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将 细胞悬液加入 l〇cm皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞冻存：

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法步骤进行， zui的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加 DMSO 至终浓度为10%。加入 DMSO 后迅速混匀，按每 lml 的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于 1X106个细胞冻存。

细胞接受后的处理：

1. 收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。

2. 请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将 T25瓶置于 37°C 培养约 2-3h〇

3. 弃去 T25瓶中的培养基，添加 6ml 本公司附带的完全培养基。

4. 如果细胞长满（90%以上）请及时进行细胞传代，传代培养用 6ml 本公司附带的完全培养基。

5. 接到细胞次日，请检查细胞是否污染，若发现污染或疑似污染，请及时与我们取得联系。

培养方法：

收到细胞后，在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：

如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，留10ml培养液继续培养。

如果细胞已长满（达80-90%）。即可进行传代，具体步骤如下：

a，弃去培养液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶内加入1.0-2.0ml胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，吸取胰蛋白酶，加含有6ml 含10%血清的培养液，轻轻吹打细胞。

c，加入等量的的培养液，轻轻吹打混匀后吸出一半，分到新的培养

d，传代比例：1:2-1:3

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心 5分钟，弃去上清液，补加 l-2mL 培养液后吹句，将细胞悬液按 1: 2到 1: 5的比例分到新的含 8ml 培 养基的 新皿中或者瓶中。 

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细 胞悬 液按 1: 2到 1: 3的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

操作要点：

1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

友情提示注意以下几点：

1、收到细胞后请尽快更换为含15%血清的新鲜培养基，如因特殊情况需要继续使用原瓶，请在原瓶培养基中额外添加10%的血清

2、贴壁细胞收到当天切忌立刻消化，请将细胞换液后放置培养箱孵育到第二天再做消化传代，请优先选择直径6cm的培养皿进行传代培养

3、如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时做好照片记录并联系实验室

 运输和保存：

使用含有you质胎牛血清的 2ml 冻存管发送存活细胞。收到细胞后，可在1000RPM，常温条件下，离心 5min 后，于洁净操作台弃去上清，加入推荐 使用的培养基后转移至 l〇cm 培养皿或者 T25培养瓶中培养，传代达到细胞生长状态良好时， 再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

细胞用途：仅供科研使用。

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