酶联免疫吸附测定（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上，利用抗原抗体结合一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

本讲以双抗体夹心法为例，详细阐述ELISA的操作流程及技术要点，希望对科研朋友的实验有所帮助。

2. 重要提示

2.1 实验开始，请提配置好所有试剂。试剂或样本稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

2.2 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便管盖和管壁上的液体集中到管底。

2.3 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

2.4 span class="text-yellow">因实际装量多于标示装量，配制工作试剂请用准确的计量工具（移液枪或量筒等）量取，切勿不经量取直接使用。

2.5 标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液稀释根据预先计算好的每次实验所需的总量配制，实际配制时应多配制0.1-0.4mL。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

2.6 标准品的稀释请勿于板中进行，标准品应于临用15分钟内配制。为确保实验有效性，建议每次实验使用新的标准品。若保存得当，溶解后的标准品S7可在2-8℃保存，7天内使用有效。

3. 操作步骤

为确保检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。推荐样本稀释方案：建议老师先做预实验摸索样本适合的稀释倍数，然后再做正式实验。

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本稀释液孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗体100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育60min。

4、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

5、除空白孔外，每孔加入HRP标记亲和素100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育20min。

6、重复步骤4。

7、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育15min。

8、所有孔加入终止液50μL，在450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

[操作概要]

4. 操作要点

4.1 为确认检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。

4.2 如标本中待测物质含量过高，请先用样本稀释液进行稀释，以使样本符合试剂盒的检测范围，末了计算时再乘以相应的稀释倍数。

4.3 加样：加样时，请使用一次性的洁净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于酶标板孔底部，切勿沿孔壁加样。一次加样时间适合的控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4.4 温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。

4.5 洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

● 手工洗板方法：吸去（不可触及孔壁和孔底）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液按200μL/孔注入孔内，浸泡2分钟。根据操作步骤中所述，重复此过程数次。

● 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

4.6 显色：为确认实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间（比如每隔10分钟）。当肉眼可见标准品3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

4.7 底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。

原创作者：杭州臻优品生物科技有限公司