Q: 什么是特定的抗体？

抗体（Ab），也被称为免疫球蛋白（Ig），是一种Y型的蛋白质，通过Fab区域的可变区域来中和病原体，例如致病性细菌和病毒。

Q: 如何选择适合我的实验的正确抗体？CUSABIO是否提供具有多种应用的抗体？

您在选择抗体时需要注意以下几个方面：样本的物种、抗体的宿主物种、抗体的标记方式以及适用于您实验的推荐稀释比例。CUSABIO确认其抗体适用于标注在网站或产品数据表上的应用和物种。如果您使用的应用我们没有测试过，我们将为您提供试用样品，在购买正装之进行评估。

Q: 单克隆抗体和多克隆抗体有什么区别？

单克隆抗体是使用相同的克隆免疫细胞制备而成，它们都是来自一个特定的母细胞的克隆。因此，它们对同一抗原和表位具有亲和力。多克隆抗体是使用多个不同的免疫细胞制备而成，它们对同一抗原具有亲和力，但结合的表位不同。单克隆抗体只结合一个表位，而多克隆抗体则结合同一蛋白质上的不同表位。单克隆抗体比多克隆抗体更加特异且背景噪音更少，因此在生化分析中通常更可取。然而，单克隆抗体的生产成本通常更高，适应性较差，并且对抗原的微小变化非常敏感。

Q: 一抗和二抗之间有什么关系？如何选择适合我实验的正确二抗？

一般情况下，一抗用于捕获目标蛋白，二抗能够与一抗结合，并且标记有可以放大检测信号的酶或染料。我们建议您考虑以下几个因素：

a. 根据宿主物种选择。例如，如果一抗来自小鼠，那么二抗应该是抗小鼠的。

b. 根据一抗的特性选择。

c. 根据您的实验应用，例如WB、IHC、ELISA等。

Q: 您能告诉我每个抗体结合多少个生物素吗？

生物素与抗体的摩尔比为36.6:1。然而，很难准确说出每个抗体结合了多少个生物素，因为标记是通过赖氨酸残基进行的，并不清楚有多少个原始氨基团与生物素结合。平均而言，每个IgG分子可以结合3—5个生物素分子。

Q: 为什么实际带状物的分子量大于理论分子量？

您可以使用CUSABIO的分子量计算器计算抗体的分子量。如果测试结果与理论分子量之间有很大差异，可能的原因包括：目标蛋白存在多个修饰位点，例如糖基化，或者与其他蛋白质形成稳定的复合物，或者被切割或降解。

Q：为什么我收到的抗体容量少于标签上所标示的容量？

在运输和储存过程中，少量的抗体可能会附着在产品瓶盖的密封处。如果需要，可以在台式离心机上对瓶子进行短暂离心，以使容器盖中的液体脱离。

Q: 您能为该抗体推荐同型对照吗？

同型对照用于确认一抗结合的特异性，以排除非特异性Fc受体结合或其他蛋白质相互作用的影响。同型对照抗体应与一抗的宿主物种、同型和标记方式相匹配。例如，如果一抗是FITC标记的小鼠IgG1，那么您需要选择一款FITC标记的小鼠IgG1同型对照。大多数同型对照抗体是单克隆抗体，多克隆抗体不适用，因为多克隆抗体含有多个IgG亚类。

Q: 用哪种缓冲液来储存抗体？

我们使用0.01M PBS缓冲液（pH 7.4）加入50%甘油。

Q: 您可以提供哪种类型的抗体标记？

我们目提供FITC、HRP、生物素等随机标记在游离的赖氨酸（Lys）氨基上的标记。

Q: 为什么有些抗体不再提供？

我们从库存中剔除这些抗体，是因为我们有新的产品替代它们。

Q: 为什么在免疫印迹（Western Blot）中没有带状物？

可能存在的原因有：

a. 抗体不足。一些抗体可能与目标蛋白的亲和性较差。您应该减少抗体的稀释倍数（比推荐的起始稀释度低2-4倍）。同时，抗体可能已失去活性，您应该进行点印迹（Dot Blot）实验。

b. 蛋白质不足。您应该提高在凝胶上加载的总蛋白质量。通过其他方法确认蛋白质的存在。使用阳性对照（重组蛋白、细胞系或处理细胞以表达感兴趣的分析物）。进行点印迹实验。

c. 转膜不良。您应该用甲醇湿润PVDF/Immobilon-P膜，或者用转膜缓冲液湿润硝酸纤维膜，以确保PVDF膜与凝胶之间有良好接触。

d. 转膜不全部。您应该延长转膜时间，因为一些分子量较大的蛋白质可能需要更长的转膜时间。

e. 过度转膜。对于分子量较小（低于10 kDa）的蛋白质，您应该减少转膜电压或时间。

f. 等电点大于9。您应该使用更高pH值的替代缓冲体系，如CAPS（pH 10.5）。

g. 使用了错误的二抗。您应该确认一抗的宿主物种和抗体类型，以选择正确的二抗。

h. 抗体无效。不要使用过期的抗体。

i. 存在偶氮二碘苯酚（Sodium azide）污染。确保缓冲液不含偶氮二碘苯酚，因为它可能熄灭HRP信号。

j. 一抗的孵育时间不足。您应该延长一抗的孵育时间，上好是过夜孵育在4℃。

Q: 在免疫印迹（Western Blot）中为什么信号弱？

可能存在的原因有：

a. 蛋白质与抗体结合较弱。您应该尽量减少洗涤次数。减少抗体溶液中的NaCl浓度，或者在洗涤步骤中使用印迹缓冲液（推荐范围为0.15 M-0.5 M）。

b. 抗体不足。您应该将抗体浓度增加到比推荐的起始浓度高2-4倍。

c. 蛋白质不足。您应该提高在凝胶上加载的总蛋白质量。

d. 反应偶联不活性。您应该在管中混合酶和底物。如果颜色不显现或者颜色较弱，可以制备新的试剂或购买新的试剂。尝试使用ECL。

e. ECL试剂过弱/过旧。您应该购买新的ECL试剂。

f. 脱脂奶可能掩盖了某些抗原。您应该减少阻断液中脱脂奶的百分比，或者用3%牛血清白蛋白（BSA）代替。

Q: 为什么在免疫印迹（Western Blot）中出现额外的带状物？

可能存在的原因有：

a. 主抗体的非特异性结合。您应该增加主抗体的稀释倍数。减少在凝胶上加载的总蛋白质量。使用单克隆抗体或抗原亲和纯化的抗体。

b. 二抗的非特异性结合。您应该进行一个只用二抗的对照试验（不加主抗体）。如果出现条带，则选择其他二抗，使用单克隆抗体或抗原亲和纯化的抗体。

c. 分析物的降解。您应该尽量减少样品的冻融循环，存储向样品中添加蛋白酶抑制剂，或制备新鲜样品。

d. 分析物的聚集。您应该增加DTT的用量以确保还原二硫键（20-100 mM DTT）。在加载凝胶，将样品置于沸水中煮沸5—10分钟。进行短时间的离心。

e. 试剂的污染。您应该检查缓冲液是否被污染，或者尝试制备新鲜的试剂。

Q: 在免疫印迹（Western Blot）中为什么会出现条状模糊？

可能存在的原因有：

a. 主抗体的非特异性结合。您应该将单克隆抗体或抗原亲和纯化的抗体以更低的浓度稀释在5%牛奶中，或者调整非脱脂奶粉（2%-5%）或NaCl（0.15-0.5 M）浓度作为主抗体溶液。

b. 二抗的非特异性结合。您应该进行一个只用二抗的对照实验（不加主抗体）。如果在膜上出现了条带，则应该稀释该抗体或尝试其他二抗。

c. 阻断不足。您应该使用含有0.1%—0.5% Tween 20、0.15-0.5 M NaCl和25 mM Tris (pH 7.4）的5%脱脂奶粉溶液进行阻断。可以延长阻断时间。根据需要调整奶粉浓度。在4℃下过夜阻断可能会降低阻断效果，因为低温下洗涤剂可能不起作用。

d. 洗涤不足。您应该增加洗涤缓冲液中Tween 20的浓度（0.1%—0.5%），或增加洗涤次数。

e. 脱脂奶粉中可能含有目标抗原或内源性生物素，并且与亲和素/链霉亲和素不相容。您应该使用3% BSA进行替代。

f. 某些IgY抗体可能会识别奶蛋白。您应该使用3% BSA进行替代。

g. 胶片曝光过度。您应该减少曝光时间。如果目标信号过强，请多等待5—10分钟后重新曝光胶片。

Q: 在免疫印迹（Western Blot）中，为什么条带看起来模糊且不规则？

可能存在的原因有：

a. 凝胶不好。在填充之应全部搅拌溶液。

b. 某些样品的盐浓度较高。您应该对样品进行脱盐或调整盐浓度。

c. 每个孔中的样品体积不一致。您应该调整样品体积，使其基本相同。

d. 缓冲液不起作用。您应该购买新的缓冲液或制备新的缓冲液。

e. 膜中有气泡困住。在转膜过程中要小心地去除任何气泡。

f. 电泳过程中温度过高。您应该减小电流或电压。

Q: 在免疫印迹（Western Blot）中，为什么转膜效率低？

可能存在的原因有：

a. pH值接近等电点。您应该增加转膜缓冲液的pH值。

b. 膜中有气泡困住。在转膜过程中要小心地去除任何气泡。

c. 滤纸接触。滤纸、转膜和凝胶的大小应基本相同，以避免滤纸直接接触。

d. 转膜选择不当。您应该使用可靠的PVDF膜或硝酸纤维膜。

e. 电压或电流过低。我们建议在湿转膜过程中使用20 mA的恒定电流，半干转膜时使用25 V的恒定电压。

f. 转膜时间过长或过短。根据蛋白质的大小和使用的电泳设备，选择适当的转膜时间。

g. 湿转膜过程中环境温度过高。您应该使用预冷的转膜缓冲液或将装置设置为4℃。

Q: 在免疫组织化学染色中，为什么染色缺失？

可能存在的原因有：

a. 缺乏抗原。我们建议通过原位杂交检测蛋白质的表达，因为在某些罕见情况下，即使已检测到mRNA，蛋白质的翻译可能被阻断。

b. 抗原在与一抗孵育之被破坏。如果在添加一抗之进行了内源性过氧化物酶的消除，您应该在与一抗孵育后对过氧化物酶进行阻断。

c. 抗原恢复效果不好。您应该增加处理时间或更换处理溶液。

d. 抗体因存储不当而失效。您应该按照手册上的存储说明操作。通常将抗体分装成足够制备单次实验的小体积，避免反复冻融。

e. 一抗或二抗失活。您应该独立测试报告系统以评估试剂的有效性。

f. 一抗和二抗不兼容。您应该使用能与一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗是兔源的，则使用抗兔二抗。

g. 组织固定不充分。您可以尝试增加固定时间或尝试不同的固定剂。

h. 组织过度固定。您应该减少浸泡或后固定步骤的时间。如果无法避免浸泡固定，可以通过使用抗原恢复试剂来使抗原重新显露。

i. 抗原在固定或包埋过程中发生变化。您可以尝试通过各种抗原恢复技术来恢复免疫反应性。

j. 遗漏或错误使用试剂。您应该重复染色，并确认正确使用了正确顺序的试剂。

Q: 在免疫组织化学染色中，为什么染色结果不合适？

可能存在的原因有：

a. 固定方法对抗原不适用。您可以尝试不同的固定剂或增加固定时间。

b. 抗原恢复方法对该抗原或组织不适用。您可以尝试不同的抗原恢复条件。

c. 抗原的静电荷发生了变化。您可以尝试调整抗体稀释液的pH值或阳离子浓度。

d. 固定延迟导致抗原扩散。您应该及时固定组织，并尝试使用交联固定剂而不是有机（醇）固定剂。

Q: 在免疫组织化学染色中，为什么背景较高？

可能存在的原因有：

a. 一抗和/或二抗浓度过高。您应该进行滴定实验，确定促进一抗和二抗特异反应所需的上好浓度。

b. 一抗或二抗与组织的非特异性结合。您应该在一抗孵育之进行阻断步骤。非脂乳粉是另一个选择。

c. 二抗的非特异性结合。您应该使用去除了交叉反应IgG物种的抗体（对样本物种进行吸附）。

d. 抗体与组织中的蛋白质之间的疏水相互作用。您应该降低抗体稀释液的离子强度。

e. 背景由离子相互作用引起。您应该增加稀释缓冲液的离子强度。

f. 组织变干。在染色过程中避免组织变干。

g. 试剂附着在老旧或准备不良的玻片上。您应该重新准备新鲜的或购买的玻片。

Q: 在免疫组织化学染色中，为什么组织或细胞形态会被破坏？

可能存在的原因有：

a. 抗原恢复方法过于严酷。您应该根据经验确定能够保持组织形态的条件，同时恢复抗原的免疫活性。

b. 组织切片脱落玻片。您应该增加固定时间。根据经验确定额外或替代性的固定剂。使用新鲜制备的、电荷充足的玻片。

c. 染色过程中未全部固定导致物理损伤组织或细胞。您应该增加固定时间和/或增加后固定步骤。增加固定剂/组织比例。切割更小的组织块以进行更透彻地浸润固定。

d. 组织自溶导致坏死碎片染色。您应该增加固定时间和比例。考虑使用交联固定剂。

e. 组织切片出现撕裂或折叠。您应该在切片下除去气泡。使用锋利的刀片重新切割切片，或在分析结果时忽略损坏区域。

f. 组织形态分辨率差。对于冰冻切片，应该切割更薄的组织切片，因为冰晶可能破坏了组织形态。

Q: 在免疫沉淀（IP）中，为什么会有太多的抗体洗脱？

您应该在进行免疫沉淀将抗体与珠子混合，并使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱，这样可以显著减少抗体的数量。

Q: 为什么免疫沉淀（IP）中的背景太高？

可能存在的原因有：

a. 抗体与非特异性结合过多。您应该使用纯化的抗体，并减少使用的量。

b. 细胞过多/蛋白质过多导致洗脱物中存在大量非特异性蛋白质。减少使用的细胞数量/裂解液（10-500 µg）。

c. 不能溶解的蛋白质残留。在离心后立即去除上清液。这样应该将不溶性蛋白质留在沉淀中。如果重新悬浮发生，再次离心。

d. 准备的珠子过少。您应该确保BSA新鲜，并使用足够的珠子在PBS中含有1%的BSA中孵育1小时。在使用之用PBS洗涤3—4次。

e. 洗涤不透彻。您应该在相关阶段进行充分的洗涤，将盖子盖在离心管上，并在离心之多次倒置。

f. 在免疫沉淀过程中，抗原降解。您应该在裂解之添加新鲜的蛋白酶抑制剂。

Q: 在染色质免疫沉淀（ChIP）中，为什么大区域显示低分辨率且背景噪音高？

您应该优化DNA的片段（不超过1.5 kb）。

Q: 为什么在染色质免疫沉淀（ChIP）中样本中无法扩增DNA？

您应该选择阳性对照模板DNA来确认引物的工作情况。

Q: 在流式细胞术（FC）中为什么会有高背景？

可能存在的原因有：

a. 增益设置过高。您应该降低增益以减少信号，并使用阳性对照来正确设置流式细胞仪。

b. 抗体过多。您应该减少抗体浓度。

Q: 为什么在流式细胞术（FC）中观察到两个或更多的细胞群体？

可能存在的原因有：

a. 存在多个细胞群体表达目标蛋白。您应该检查细胞分离是否充分。

b. 存在细胞二聚体。细胞二聚体将显示为图上大约两倍荧光强度的第二个细胞群体。您应该在染色之和在流式细胞仪上运行之使用移液管轻轻混合细胞。

Q: 我应该如何储存和分装抗体？

抗体在室温下只稳定几天。请在收到后将抗体分装并储存在-20℃。请避免反复冻结和解冻，您可以根据实验中使用的量来分装抗体，但每个分装物的量不应少于10 μL。每个分装物的量越小，液体蒸发和容器吸附对抗体浓度的影响就越大。

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