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人抵抗素(RETN)ELISA试剂盒Human RETN(Resistin) ELISA Kit
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详细内容
本试剂盒采用双抗体夹心两步法酶联免疫吸附试验(ELISA)。在预包被抗检测蛋白抗体(固相抗体)的微孔酶标板中,加入牛检测蛋白校准品和待测样本,再加入生物素标记抗体,经过温育与充分洗涤后,再加入HRP偶联的亲和素,经过温育与充分洗涤,去除未结合的组分,在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-生物素标记抗体-亲和素酶的夹心复合物。加底物A和B,产生蓝色产物,在终止液作用下,终转化为黄色,在酶标仪450nm波长上测定吸光度(OD值),吸光度(OD值)与待测样品中检测蛋白的浓度正相关。拟合校准品曲线,可以计算出样本中检测蛋白的浓度。
试剂盒组分与保存
组分 | 数量 | 主要成分 | 开封后储存 |
校准品 | 0.35ml/管 | -- | 2-8℃14天 |
包被微孔板 | 96T/48T | 预包被固相抗体 | 2-8℃14天 |
生物素抗体 | 10mL | 生物素抗体 | 2-8℃180天 |
HRP标记亲和素 | 10mL | HRP标记亲和素 | 2-8℃14天 |
样本稀释液 | 6mL | PBS | 2-8℃180天 |
底物液A | 6mL | 0.01%过氧化氢 | 2-8℃180天 |
底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
终止液 | 6mL | 2mol/L酸 | 2-8℃180天 |
20×浓缩洗涤液 | 25mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
说明书 | 1份 | -- | -- |
自封袋 | 1个 | -- | -- |
不干胶 | 4片 | -- | -- |
注意:
1:使用请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致。
2:如果试剂盒的组份需要再次使用,请确保上一次使用之后没有被污染。
3:酶标板单次未使用完,要谨记密封放到2-8℃保存。
试验所需自备试验器材 (不提供,但可协助购买)
1.标准规格酶标仪。
2.自动洗板机。
3.振荡器。
4.系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,好用多通道移液器。
5.用去离子水将 25×TBS-T 洗涤缓冲液稀释 25 倍,成 1×TBS-T 洗涤缓冲液。
样品的准备和保存
以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中,不得使用叠氮钠做为防腐剂。样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
细胞培养上清——离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清——用干净试管收集血液,室温凝固 30 分钟,离心 2000×g 20 分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆——采用肝素、柠檬酸盐或 EDTA 抗凝,抽血后 30 分钟内在 2-8℃离心 2000×g 20 分钟。为消除血小板的影响,建议在 2-8℃进一步离心 10000×g 10 分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞裂解液——对于贴壁细胞,去除培养液,用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液,用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常 10 后,细胞就会被裂解。对于悬浮细胞,离心收集细胞,用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液,用枪吹打把细胞吹散,用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后,10000—14000×g 离心 3-5 分钟, 取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
尿液——用无菌管收集,离心 2000×g 20 分钟。仔细收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。
操作程序
所有试剂和组分都先恢复到室温,标准品、质控品和样品,建议做复孔。
1、按面说明书描述的方法,配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、从铝箔袋中取出所需板条,剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL,样本稀释液孔加样本稀释液50μL,空白孔不加,样本孔加待测样本50μL。除空白孔外,每孔加入生物素抗体100uL,用封板膜盖住反应板,37℃水浴锅或恒温箱避光温育60min。
4、揭开封板膜,弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复5次。若使用自动洗板机,请按洗板机操作程序进行洗板,添加浸泡30s的程序,可以提高检测的精度。洗板结束,加底物,要在干净不掉屑的纸上,充分拍干反应板。
5、除空白孔外,每孔加入HRP标记亲和素100uL,用封板膜盖住反应板,37℃水浴锅或恒温箱避光温育20min。
6、重复步骤4。
7、将底物A和B按1:1体积充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板,37℃水浴锅或恒温箱避光温育15min。
8、所有孔加入终止液50μL,在450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度(OD值)。
结果计算
9、以标准品浓度做为横坐标,对应的吸光度(OD值)作为纵坐标,利用计算机软件,采用四参数Logistic曲线拟合(4-pl),创建标准曲线方程,通过样本的吸光度(OD值),利用方程计算样品的浓度值。【用ELISA Calc软件计算】
10、如果样品被稀释,通过上述方法测的的浓度值,要乘以稀释倍数,才是样品的终浓度。
经典数据
(1)标准曲线:
以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。每次检测,每块酶标板都必须设立标准曲线。
(2)精密度:
批内精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在同一个板块内精度评估。
批间精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在不同板块内精度评估。
| 批内变异系数 | ||
样本 | 1 | 2 | 3 |
数量 | 20 | 20 | 20 |
平均值(250) | 68.59 | 299.38 | 1040.75 |
标准差 | 5.46 | 14.88 | 68.27 |
变异系数 (%) | 7.96 | 4.97 | 6.56 |
| |||
| 批间变异系数 | ||
样本 | 1 | 2 | 3 |
数量 | 20 | 20 | 20 |
平均值(250) | 71.88 | 280.16 | 1060.72 |
标准差 | 6.43 | 26.56 | 103.95 |
变异系数 (%) | 8.94 | 9.48 | 9.8 |
(3)灵敏度:
低检出剂量小于15.63 pg/mL(6 次独立实验的平均值)。
10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD,计算低可检测浓度。
(4)回收率:
分别往不同样本中添加已知的高、中、低浓度目的蛋白样品,进行五次在同一个板块内回收率评估,回收率在85%-115%之间。
样本类型 | 回收率范围(%) | 平均回收率(%) |
血清(n=5) | 89-102 | 95 |
血浆(EDTA)(n=5) | 89-106 | 98 |
细胞培养基(n=5) | 86-101 | 95 |
(5)稀释线性:
将添加有高浓度牛白介素8(IL-8)ELISA试剂盒的样本分别稀释 2 倍,4 倍,8 倍,16 倍做回收实验,得出回收率范围及平均回收率。
|
| 血清 | 血浆(EDTA)(n=5) | 细胞培养基(n=5) |
1:2 | 回收率范围(%) | 95-113 | 94-111 | 93-110 |
平均回收率(%) | 96 | 98 | 96 | |
1:4 | 回收率范围(%) | 82-115 | 85-112 | 86-112 |
平均回收率(%) | 97 | 97 | 98 | |
1:8 | 回收率范围(%) | 86-111 | 86-113 | 94-108 |
平均回收率(%) | 102 | 96 | 103 | |
1:16 | 回收率范围(%) | 91-113 | 84-108 | 94-105 |
平均回收率(%) | 98 | 98 | 99 |