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技术文章
人胃饥饿素（Ghrelin）定量检测试剂盒（ELISA）
点击次数：211 发布时间：2023/12/4 9:50:50
仅供科研使用，不得用于临床诊断
人胃饥饿素（Ghrelin）定量检测试剂盒（ELISA）
定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人胃饥饿素 （Ghrelin）的
浓度。
使用试剂盒，必须仔细阅读本说明书。
实验原理
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人胃饥饿素 （Ghrelin）
抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人胃饥饿素 （Ghrelin）校准品和待测样本，再加
入另一株 HRP 标记的抗人胃饥饿素 （Ghrelin）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去 除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，终转化为黄色， 在酶标仪 450nm 波长上测定吸光度（OD 值），吸光度（OD 值）与待测样品中人胃饥饿素 （Ghrelin）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人胃饥饿素 （Ghrelin）的 浓度。
试剂盒限制性
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测，请排出该因素。
7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
技术提示
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样,避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是实验结果准确性的必要条件。
4、使用自动洗板机时，加入一个 30 浸泡的步骤，可以提高检测精度。
5、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
6、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄
色。
7、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
8、所有液体组分，使用充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。仅供科研使用，不得用于临床诊断。
试剂盒组分与保存
未开封的试剂盒保存在 2-8 度，不得使用过期试剂盒。
其他用品
1、酶标仪（450nm）
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml
量筒
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有 proclin-300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾
与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。
4、戴上防护手套，实验完成后洗手。仅供科研使用，不得用于临床诊断。
样品的采集和储存
以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠
做为防腐剂。
1、细胞培养上清：4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃ 以下，避免反复冻融。
2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，保存在-20℃以下，避免反复冻融。
3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在 4000rpm 条件下，离心 20 分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。 样本收集后，无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温 下解冻，确保样品均匀充分解冻。
4、组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。 将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按 1: 9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9 mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制 剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行 超声破碎或反复冻融。后将匀浆液 5000×g 离心 5-10 分钟，取上清检测。
5、细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟 后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次。每 1×106 个 细胞中加入 150-200μLPBS 重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少 PBS 的体 积)。将提取液于 1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。
6、其他生物体液：1000×g 离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
试剂准备
1、使用，所有的组分都要至少复温 60min，确保充分复温到室温。
2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结
晶、全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按 1:20 稀释，即 1 份的浓缩洗涤液，添加 19 份的蒸
馏水。
3、底物：底物液 A 和 B，在使用，按 1:1 体积充分混合，混合后 15 分钟内使用。
操作程序
所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
1、按面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。 设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值 孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。
3、除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL。
4、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育 60min。
5、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩去洗涤液，吸水
纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s 的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
6、将底物 A 和 B 按 1:1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反 应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育 15min。
7、所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD 值）。
结果计算
1、 以标准品浓度做为纵坐标（6 个标准品孔，加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点），对应的吸光 度（OD 值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），创 建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。
2、 如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的终浓度。
试剂盒性能指标
1、物理性能
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破
损漏气。
2、剂量反应曲线线性
校准品剂量反应曲线相关系数 r 值，大于等于 0.9900。
3、精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。
批内变异系数 CV%小于 10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批
间变异系数 CV%小于 15%。
4、灵敏度
检出剂量小于 1.0 pg/mL。
5、回收率
三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在
85%-115%之间。
6、特异性
本试剂盒识别天然和重组人胃饥饿素（Ghrelin），与结构类似物无交叉。
7、稳定性
2℃-8℃保存，有效期 6 个月。
8、 检测范围
31.25 pg/mL – 1000 pg/mL。
原创作者：天津越腾生物技术有限公司
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