未开封的试剂盒保存在 2-8 度，不得使用过期试剂盒。

以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠 做为防腐剂。

1、细胞培养上清：4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃ 以下，避免反复冻融。

2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激， 4000rpm 条件下离 心 20min，小心地分离出血清，保存在-20℃以下，避免反复冻融。

3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在 4000rpm 条件下，离心 20 分钟取上清， 血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

样本收集后，无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温 下解冻，确保样品均匀充分解冻。

4、组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。 将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按 1: 9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9 mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制 剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行 超声破碎或反复冻融。 后将匀浆液 5000×g 离心 5-10 分钟，取上清检测。

5、细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化， 1000×g 离心 5 分钟 后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。 收集的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次。每 1×106 个 细胞中加入 150-200μLPBS 重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少 PBS 的体 积)。将提取液于 1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。

6、其他生物体液： 1000×g 离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

大鼠14-3-3家族z蛋白(1433PF）elisa检测试剂盒自备用品

1、酶标仪(450nm)

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、500ml 量筒

大鼠14-3-3家族z蛋白(1433PF）elisa检测试剂盒准备工作

1、使用， 所有的组分都要至少复温 60min，确保充分复温到室温。

2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结 晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按 1:20 稀释，即 1 份的浓缩洗涤液，添加 19 份的蒸 馏水。

3、底物： 底物液 A 和 B，在使用， 按 1:1 体积充分混合， 混合后 15 分钟内使用。

操作程序所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
1、按面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。

3、除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记的检测抗体 100μL。

4、用封板膜盖住反应板， 37℃水浴锅或恒温箱避光温育 60min。

5、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩去洗涤液，吸水 纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡 30s 的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干 反应板。

6、将底物 A 和 B 按 1:1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反 应板， 37℃水浴锅或恒温箱避光温育 15min。

7、所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度(OD 值)。

大鼠14-3-3家族z蛋白(1433PF）elisa检测试剂盒结果计算

以标准品浓度做为纵坐标(6 个标准品孔，加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点)，对应的吸光度(OD值) 作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic曲线拟合(4-pl)，创 建标准曲线方程，通过样本的吸光度(OD 值)，利用方程计算样品的浓度值。