一.ELISA标准操作要点

优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的研玘生物要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。

1.标本的采取和保存

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP ,也会产生假阳性反应。一般说来 ,在5天内测定的血清标本可放置于4°C ,标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需- 20°C保存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。 保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。

2.加样

加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出。

3.保温

在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37°C经1-2小时,产物的生成可达顶峰。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,反应板不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成,采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应,边上的值会偏高,建议为了客观的判断结果,将质控放在非边缘位置。


4.洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤 ,但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中,洗涤是主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗剂既含疏水基团,也含基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20 ,其浓度可在0.05%-0.2%之间,于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释,应按要求稀释,所用的水电导率好在1.5us/cm之下,洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40左右,孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好,手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

5.显色和比色

TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠 ( SDS )等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间( 12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长( 450nm )测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪,通常指用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001 ,准确性为±1% ,重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15~30°C ,使用先预热仪器15-30分钟,测读结果更稳定。

测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,次在适波长(W1) ,第二次在不敏感波长( W2) ,两次测定间不移动ELISA板的位置,终测得的A值为两者之差( W1-W2 )。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

二.本底及假阳性产生的原因分析

1.基因工程抗原与合成肽抗原的区别：
（1.1）基工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点:

2.分子量大。合成肽采用化学方法制备,由于工艺的局限,合成数量有限,只能达到数百个氨基酸;而利用基因工程制备的抗原,分子量更大。

3.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证,早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4个月, 采用基因工程抗原后效期大大延长了。

4.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达,表达产物包含更多的抗原决定簇,可提高试剂盒的灵敏度,提高检出率。

5.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。

6.合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 合成肽抗原有以下特点:

（6.1）分子量太小.

（6.2）-般只含有一个抗原决定簇

（6.3）纯度高

（6.4）稳定性差

由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性, ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就HCV ELISA试剂盒来讲,代产品为合成肽抗原,主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段;第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽,只是当时的基因工程抗原不全,仅包括了HCV的核心区片段;第三代产品基本上采用了基因工程抗原,而且这些抗原包括更多更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。

由于历史的原因,人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒,因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被,该类试剂盒的流行病学敏感度不够,稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度,科学得对待反应结果。

7.假阳性本底产生的原因

（7.1）抗原因素

（7.2）融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例,因为包被的基因工程抗原为融合蛋白,包含了来自表达载体的一些序列,因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。