PCR引物设计十条原则

引物是指核酸复制是的一段引导序列，在生物细胞内的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应中人工合成的引物（通常为DNA引物）统称为引物。在PCR实验前必须设计对应的引物，其目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地引导模板DNA序列扩增。因此，引物设计的优劣直接关系到PCR的成功与否。

PCR引物设计十条原则：

1.引物的特异性

引物设计应在核酸序列的保守区内并具有特异性。

2.避免产物形成二级结构域

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，因此选择扩增片段时避开二级结构区域。

3.引物长度
寡核苷酸引物长度一般为15~30bp。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，*适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的*适温度（74℃）,影响产物的特异性。
4.G+C含量
引物G+C含量约在40%~60%。

5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布应是随机的，不应有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。3′端不应超过3个连续的G或C，避免引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构影响引物与模板的复性结合。

7.两引物之间不应具有互补性

应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间应少于有4个连续碱基具有同源性或互补性。
8.引物3′端不可修饰
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
9.引物5′端可修饰
引物的5′端决定PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。常常被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰方法有：加酶切位点；加入标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等物质；引入蛋白结合DNA序列；引入突变位点、启动子序列等。
10.引物3′端要避开密码子的第3位

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。