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一步PCR介导的降解因子整合方法
点击次数：5440 发布时间：2016/3/3 9:42:08
用于快速缺失内源性人蛋白的可选择的一步PCR介导的降解因子整合方法
科罗拉多大学医学院科学家Ryan M. Sheridan和David L. Bentley开发了一种选择性的基因盒，它采用CRISPR/Cas9基因编辑器使内源性的人蛋白的C端标记大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）降解因子。这个基因盒可以利用框内自我剪切2A多肽和嘌呤霉素抗性基因方法进行高效率正确整合。PCR扩增供体的eDHFR基因盒片段，每个片段末端带有100bp同源片段，它们通过以向导RNA为目标的可以切割3’端开放性阅读框的双链DNA同源定向修复的方法被整合。据此原理，Ryan M. Sheridan和David L. Bentley生成了含有eDHFR降解因子标签的三个内源性蛋白的细胞。当从培养基中去除抗生素甲氧苄氨嘧啶时，在2-4小时就缺失了90%以上每个带有eDHFR标签的内源性蛋白，这种缺失可以通过再次加入甲氧苄氨嘧啶得到恢复。嘌呤霉素的选择性可以利用100bp同源性片段高效率回收框内降解因子融合体。该方法可以适用于生成全基因组范围的突变细胞库。
科罗拉多大学医学院科学家Ryan M. Sheridan和David L. Bentley开发了一种选择性的基因盒，它采用CRISPR/Cas9基因编辑器使内源性的人蛋白的C端标记大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）降解因子。这个基因盒可以利用框内自我剪切2A多肽和嘌呤霉素抗性基因方法进行高效率正确整合。PCR扩增供体的eDHFR基因盒片段，每个片段末端带有100bp同源片段，它们通过以向导RNA为目标的可以切割3’端开放性阅读框的双链DNA同源定向修复的方法被整合。据此原理，Ryan M. Sheridan和David L. Bentley生成了含有eDHFR降解因子标签的三个内源性蛋白的细胞。当从培养基中去除抗生素甲氧苄氨嘧啶时，在2-4小时就缺失了90%以上每个带有eDHFR标签的内源性蛋白，这种缺失可以通过再次加入甲氧苄氨嘧啶得到恢复。嘌呤霉素的选择性可以利用100bp同源性片段高效率回收框内降解因子融合体。该方法可以适用于生成全基因组范围的突变细胞库。
原文：
Ryan M. Sheridan ａnd David L. Bentley, Selectable one-step PCR-mediated integration of a degron for rapid depletion of endogenous human protein, BioTechniques 60:69-74 (February 2016)
原创作者：北京鼎国昌盛
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