其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，然后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

本 AFLP 技术主要特点：分析所需DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；

AFLP 技术被认为是一种十分理想、有效的分子标记。

实验材料：

1.1 样品保存与运输

样品类型	样品要求
植物材料	新鲜组织、叶片采用硅胶干燥后或干冰运输到实验室
动物材料	新鲜组织，无水乙醇封存低温运输到实验室
DNA	干冰运输到实验室

实验步骤：

1.2 DNA 提取（实验方法视DNA来源而异，此处以普通植物样本为例）

CTAB法提取

1）称取材料50mg，液氮研磨三至四次

2）将粉末放到装有800µl 2×CTAB提取缓冲液的2ml离心管中

3）加入60µl巯基乙醇混匀，60度预热30min

4）其间混匀二至三次取出样品于室温放置

5）待样品冷却到室温加入800µl氯坊：异戊醇（24：1）

6）振荡混匀，12000rpm离心15min

7）取上清到一新2ml离心管，加入等体积的氯坊：异戊醇（24：1），振荡混匀，12000rpm离心15min

8）取上清到一新2ml离心管中加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液，放置20-30min，12000rpm离心15min

9）将沉淀晾干溶于200µl TE-buffer（溶解）

10）加入400 µl 95% 乙醇，20µl 3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小时

11） 4℃ 离心，12000rpm离心15min

12） 500µl 75%乙醇洗涤，12000rpm离心10min

13）加入30-50µl TE-buffer

14） 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测

备注：CTAB法主要针对植物基因组DNA的提取，其它样品：如动物组织、细胞、菌体等公司有相关试剂盒。

1.3 限制性酶切及连接反应

反应体系

组分	对照（体积）	样品（体积）
DNA模板（50ng/μl）	4μl	4μl
Adapter	1μl	1μl
EcoR I/MseI	2μl	2μl
10XReaction buffer	2.5μl	2.5μl
10mM ATP	2.5μl	2.5μl
T4 Ligase	1μl	1μl
H₂O	7μl	7μl

混匀离心数秒 37℃保温5h ，8℃保温4h，4℃过夜。

-20℃保存，作为预扩增模板

1.4 预扩增

组分

体积

DNA

2μl

Pre-ampmix（预扩引物）

1μl

dNTPs

1μl

10XPCR buffer

2.5μl

Taq 酶

0.5μl

ddH2O

18μl

离心数秒,按下列参数进行PCR扩增

94℃ 2min

94℃ 30S

56℃ 30S， 30 cycles

72℃ 80S

72℃ 5min

4 ℃

1.5 选择性扩增

预扩产物1:20稀释后作为选扩模板

按以下体系混匀后，离心数秒

组分	体积
预扩稀释样品	2μl
10XPCR buffer	2.5μl
dNTP	0.5μl
EcoRI 引物	1μl（共8种）
MseI 引物	1μl（共8种）
Taq 酶	0.5μl
ddH₂O	17.5μl
Total volum	25μl

按下列参数设置PCR循环

1）一轮扩增参数：94℃ 30S， 65℃ 30S， 72℃ 80S

2）以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。

3）接着按下列参数扩增23轮

94℃ 30S，

55℃ 30S 23 Cycles

72℃ 80S

4) 72℃ 5min

5） 4 ℃

1.6实验结果

ABI377测序仪电泳检测。数据通过GENESCAN软件进分析。

电泳图谱

峰图

遗传聚类图

实验说明：

1.7 数据分析说明

1） ROX500分子量内标

ROX500为ROX红色荧光标记的分子量内标，从小到大，片段大小依次为：70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、490、500（bp），共25条带。

2）原始数据

公司为客户提供ABI377测序仪电泳检测后的片段大小，即原始数据。数据是通过GENESCAN软件进分析，软件每2个碱基读一次数，Marker片段范围为 70-500bp，这样在70-500 bp之间一共读取216个数，由于不可避免的误差，在所设置的片段Bin Range范围内的片段，认为是同一条带，例如：在71.5-73.5 之间，c1 、c2扩增条带大小分别为73.00835 和71.9044，这样的误差范围在我们的误差允许范围认为是同一条带。

2）01数据

在原始数据的基础上，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了01数据，同时给客户发一份所有01数据汇总后的总数据。

由于软件要求，我们一般都会给客户把数据处理成NTSYSpc2.1 这个软件要求的标准的01数据格式即01总数据。01总数据中 r1-r216 表示一个引物，r217-r432 代表第二个引物和01分数据一一对应。

如：一共有8个引物：a-1、a-2、a-3、b-1、b-2、c-1、d-1…….等，在总数据中按顺序排列：

R1- r216 的数据为：a-1 这个引物的数据

R217-r432 的数据位：a-2 这个引物的数据……..，以此类推。

常见问题：

1）客户委托公司做实验服务，客户需要做哪些工作？

客户只需提供实验材料，我们负责DNA提取及后续全部试验。收到样品后，我们一般会给客户做预实验，根据客户预实验结果，客户满意度，决定是否安排后续实验。公司现有64个引物组合，全部为FAM荧光标记，我们会从中筛选条带清晰、多态性较好的引物组合给客户。在开始正式实验前，客户需支付课题服务一半的费用，余款在公司给客户发送全批数据前，一次结清。

2) 关于AFLP收费价格

目前我们的基本价格是30个样，6~8对引物，6000元，实验周期大约为20天，如果您样品较多或引物组合较多，具体可协商。

3）条带数太多

PCR产物在ABI测序仪上电泳，检测系统的灵敏度要比银染高的多，数据分析是通过GENESCAN软件进行分析，所以对于很弱的带，如果人工统计的话，不会把这样的带统计进去，但软件分析的话，会读到这样的带。所以通过测序仪检测比银染条带数多，这个可以理解。另外我们一般通过控制荧光信号强度来控制条带数，对于扩增强以及扩增相对较弱的引物，通过控制荧光信号强度，尽量保政条带数在50~60条，蕞大限度减少由于扩增强度的问题，引起的条带数的差异，*真实的反映实验结果。

4）能否找到所有差异带的具体位置，并回收克隆差异条带？

请参照提供数据结果中，原始数据部分，数据表中，每个检测位点都有片段大小，有带的地方是片段的实际大小，无带的为0，很容易找到差异带。目前我们采取的荧光引物，跑测序胶，只能指出差异带的具体位置及片段大小，不能够回收克隆差异带。

5）共有谱带较少，多态性太高

共有谱带为所有样品在某一位点扩增后共有的条带。因此只要有一个样品的扩增不好，或者在这个样品无扩增，就会导致共有普带数较少或没有。所以一定要保政实验材料新鲜，这样我们才能够保政后续试验中的PCR扩增没问题。如果样品确实有问题，为了不影响整体数据要去除这类样品。

鼎国产品推荐

DNA提取纯化试剂盒

货号

名称

品牌

规格

市场价（元）

DNA提取

GV-CT-DNA-50/100

植物基因组DNA提取试剂盒(CTAB法)

Genview

50T/100T

200/380

GV-AT-DNA-50/100

动物组织基因组DNA提取试剂盒

Genview

50T/100T

300/550

GV-WB-DNA-50/100

全血基因组DNA小量提取试剂盒

Genview

50T/100T

300/550

GV-B-DNA-50

细菌基因组DNA提取试剂盒

Genview

50T/100T

380/660

NEP001

离心柱型动物组织基因组DNA提取试剂盒

鼎国

50T/100T

300/550

NEP003

离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒

鼎国

50T/100T

400/750

NEP020

离心柱型禽类全血基因组DNA提取试剂盒

鼎国

50T/100T

360/660

NEP023

新型植物基因组DNA快速提取试剂盒

鼎国

50T/100T

280/500

NEP062

动物组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒

鼎国

50T/100T

350/600

DNA纯化回收

GV-PCR-P-50/100

DNA片段回收试剂盒

Genview

50T/100T

180/350

GV-GX-50/100

DNA凝胶回收试剂盒

Genview

50T/100T

180/350

NEP013

离心柱型溶液/凝胶DNA回收试剂盒

鼎国

50T/100T

150/240

PCR扩增相关试剂

货号

名称

品牌

规格

市场价（元）

PER001-2

Taq DNA Polymerase(10× Taq Buffer含有Mg2+)

鼎国

1000U(2U/μl)

180

PER007-1

2×Taq PCR Green Mix

鼎国

1ml

120

PER013-2

通用型PCR试剂盒

鼎国

50T

200

GD1102-1ML

dNTPs （10 mM）

Genview

1ml

PER019

10×PCR buffer（含Mg2+）

鼎国

1ml×10支

PER018-2

双蒸水ddH₂O

鼎国

500ml

100

电泳相关试剂

货号

名称

品牌

规格

市场价（元）

GA05-100G

Agarose 琼脂糖

Genview

100g

350

NEP031

5×TBE(粉剂)

鼎国

100

GT1308

5×TBE(液体)

Genview

500ml

LU362-1KG

Urea 尿素

Genview

1kg

110

GD1305-250UL

DL2000 DNA Marker

Genview

50T

100

分子标记类实验相关试剂

货号

名称

品牌

规格

市场价（元）

MMR001

AFLP试剂盒（EcoRI/MseI型）

鼎国

50T

3500

MMR001-4

AFLP试剂盒（EcoRI/MseI型）核心试剂

鼎国

50T

2500

MMR002

AFLP试剂盒（PstI/MseI型）

鼎国

50T

3500

MMR002-4

AFLP试剂盒（PstI/MseI型）核心试剂

鼎国

50T

2500

MMR003

AFLP试剂盒（HindⅢ/MseI型）

鼎国

50T

3500

MMR003-4

AFLP试剂盒（HindⅢ/MseI型）核心试剂

鼎国

50T

2500

MMR001-FISH

荧光标记AFLP试剂盒（EcoRI/MseI型）

鼎国

50T

4500

MMR002-FISH

荧光标记AFLP试剂盒（PstI/MseI型）

鼎国

50T

4500

MMR003-FISH

荧光标记AFLP试剂盒（HindⅢ/MseI型）

鼎国

50T

4500

实验相关仪器

货号

名称

品牌

规格

市场价（元）

BD-BGC1

蓝光切胶仪

博弗瑞德

台

3999

BD-BRV1

蓝光实时观测仪

博弗瑞德

台

2499

DL-600C

双稳电泳仪

东林

台

3360

DG-32A

琼脂糖水平电泳槽

东林

台

990

原创作者：北京鼎国昌盛

| 猜你喜欢

| 相关文章

已获得易推广信誉 等级评定

实验推荐——分子标记技术AFLP

实验方法原理：

实验材料：

实验步骤：

实验说明：

常见问题：

鼎国产品推荐

已获得易推广信誉等级评定