今天，Biotechniques介绍了2014年在该发表的5篇zui有趣和zui有用的PCR方法相关文章。

PCR是现代分子生物学中的一种基本技术，所以它的任何创新或改进都受到研究人员的极大欢迎。BioTechniques的编辑们一直都非常喜欢PCR方法，我们很高兴看到，2014年带来了新技术的强大选择。在这里，我们介绍了在过去一年中发表的5篇PCR方法相关论文，范围很广，从基本老式PCR反应有效性和特异性的改进，到技术如数字PCR。

1、 一种强大的耐热DNA聚合酶链置换活性可显著改善DNA扩增结果

谁不喜欢一种多功能的工具呢？当你可以用有些奇怪但很方便、孩子喜欢的叉勺时，为什么还去用勺子和叉子呢？在8月刊的BioTechniques，Ignatov等人描述了DNA聚合酶的叉勺等价物，一种可用于常规PCR反应以及等温扩增的DNA聚合酶。直到现在，这两种扩增方法还需要非常不同类型的DNA聚合酶：对于PCR来说，一种耐热DNA聚合酶（如Taq酶），可以经受住每一个PCR循环中的热变性步骤；对于等温扩增来说，一种DNA聚合酶如Bst，具有很强的链置换活性，使DNA链分开而代替热变性。Ignatov和同事们证明，一种新型Taq DNA聚合酶突变体，具有很强的链置换活性，称为SD DNA聚合酶，不仅可用于PCR和环介导等温扩增法（LAMP）以及zui近描述的聚合酶链置换反应方法，而且能够改善灵敏度和效率，即使在困难的情况下，例如长片段PCR或GC富集模板的扩增。这种多用途的新型DNA聚合酶应该是对DNA扩增酶工具箱的一种受欢迎的补充。

2、 牛凝血酶可提高聚合酶链式反应的效率和特异性

当PCR不能正常工作，或产生非特异性扩增产物和引物二聚体而不是预期的扩增子时，这是非常令人沮丧的。多年来，研究人员已经在PCR反应中添加了许多化合物，以提高DNA扩增的特异性和效率。这些添加物范围很广，从小的有机分子（例如甘油和甜菜碱）到非离子型洗涤剂（如Triton X-100和Tween，到蛋白质如BSA）。不幸的是，每一种添加物只在一组特定的条件下改善PCR扩增结果。真正理想的状态是，一种PCR增强剂在尽可能多的不同情况下都可以起作用，Xinhui Lou及其同事偶然发现了牛凝血酶（BT）。他们在12月份发表的论文中描述道，BT在低于BSA 20到180倍的浓度，能改善范围广泛的模板DNA的PCR特异性和效率，同时还能够缓解纳米材料（如氧化石墨烯和金纳米粒子）引起的抑制作用。

3、 在PCR之前线性扩增模板可改善低模板DNA的结果

一种重要的PCR扩增是，扩增少量的源DNA，为法医或古DNA研究提供足够的材料。然而，一个主要的问题是，提供足够多的DNA，往往必须扩大PCR循环的次数，以用于基因型分型应用，这会引起随机抽样效应，导致等位基因或位点脱离或杂合等位基因丢失，从而使基因型分型很难或者不可能。作为一种解决方案，Kelly Griesdale和Angela van Daal假设，在PCR扩增之前，与单独PCR扩增相比，少量目标DNA的线性扩增用于基因型分型，将会以一种更具代表性的方式，增加模板的数量。使用这种方法，他们能够证明，与不用pre-PCR线性扩增步骤的样品相比，从越来越少的人类基因组DNA的多重STR基因型分型重新获得的等位基因总数显著提高。

4、 利用QIAshredder而不是限制性内切酶为液滴数字PCR准备DNA的优点

作为PCR的版本，数字PCR已经成为定量分析高准确度靶序列的一种日益流行的方法。该技术的一个重要方面在于，在PCR之前，DNA样本在大量分区之间的平均分布，无论是在微流控well还是在微油滴。然而，当使用大量基因组DNA时，高粘度可以影响平均分区。在这些情况下，制造商通常建议在分区步骤之前限制性消化DNA样本。然而，这样的反应可能是费时耗力的步骤，更不用说限制性缓冲液还会负面地影响后续的PCR。在4月份发表的一篇论文中个，Yukl等人表明，QIAshredder——含有一种生物聚合物（可降低粘度，据报道可剪切DNA）的微型离心机旋转柱，可以代替限制性消化使用，来为液滴数字PCR（ddPCR）准备基因组DNA，从而在很宽范围的输入DNA数量测出更大的拷贝数。因为它节省时间和劳动力，所以当为ddPCR准备大量基因组DNA时，QIAshredder可以被看作是限制性消化的一种不错的替代法。

5、 在单一液滴数字PCR反应中同时定量可变剪接转录本

数字PCR的一个应用就是，定量来自于一个基因的可变剪接mRNA的相对数量。Yun-Ling Zheng及其同事们感兴趣的是，检测人端粒逆转录酶（hTERT）基因产生的20个左右的剪接变体中的4个特定剪接变体。这四个转录本不同之处在于，它们是否包括α外显子和/或β外显子，因为它们出现在许多类型的肿瘤中，因此是潜在的癌症生物标志物。他们担心，以前测定这4种剪接变体（α–/β+; α+/ β –; α–/ β –; α+/ β+）的qPCR试验不够敏感，因为它们的表达水平较低，作者决定转而使用液滴数字PCR（ddPCR）。在6月刊发表的论文中，他们设计了一种方法，在一个单一的ddPCR反应中同时测定α和β外显子的有无，而不是用标准方法，为每个样本设置两次ddPCR反应，以测定每个外显子。只使用一对PCR引物和两种不同的双标记荧光水解探针，Zheng的研究小组能够在每个样本的单次反应中比较四种剪接异构体的水平。

在考虑2014年这五大BioTechniques PCR方法相关论文时，我们非常高兴地发现，研究人员仍在继续改善PCR的各个方面，从基本的扩增策略到技术，如数字PCR。我们希望这一令人鼓舞的趋势在来年将会继续。

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