伪狂犬病毒PCR检测试剂盒使用说明

【试剂盒简介】

      猪伪狂犬病毒PCR 检测试剂盒，采用聚合酶链反应（PCR ）技术检测猪血清和组织中的PRV，适用于PRV的检测、诊断和流行病学调查。

【原理】

      提取DNA作为模板，在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。

【试剂盒组份】

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注：塑料袋内试剂（阳性对照、蛋白酶K、PCR反应液A和B）-20 ℃冻存，其他室温保存。

【操作方法】

一、样品制备

1样品采集：病死或扑杀的猪，取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理盐水中，或用注射器取血5 mL，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）

2样品处理：

2.1 组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心5 min，取上清100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中，加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

2.2 全血样品的处理：待血凝后取血清放于离心管中，8000 rpm离心5 min，取上清100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中，加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

2.3 阳性对照的处理： 混匀后取100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中，加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

2.4 阴性对照的处理： 混匀后取100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中，加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

二、病毒DNA的提取

1. 取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL抽提液（用抽提液之前不要晃动，不要吸到上层保护液），用力颠倒10次混匀，12,000 rpm 离心10min。

2. 取500µL上清置于灭菌离心管中，加入500µL异丙醇，混匀，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管，室温融化，13,000 rpm 离心15min。

3. 弃上清，沿管壁缓缓加入1mL 洗涤液，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。

4. 用30µL无菌水溶解沉淀，作为模板备用。

三、PCR

1. 反应体系：分别取16µL PCR反应液A（用前混匀）、2µL PCR反应液B（用前混匀）和2µL模板DNA，混匀。

2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序： 94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、55℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

四、电泳

1. 制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。

2. 电泳：待胶凝固后，取5µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。

3. 染色：取50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。

【结果判断】

      阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为猪伪狂犬病毒阳性，否则为阴性。

【需用但未提供的材料】

      组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、灭菌1.5mL 离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）。

【注意事项】

1．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的组分不要混用。

2．所有试剂应在规定的温度储存，使用时拿到室温下，使用后立即放回。

3．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。

4．严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

5．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。

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