禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒使用说明书

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【试剂盒简介】

      禽流感病毒RT-PCR 检测试剂盒，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测禽组织、分泌物和排泄物中所有亚型的AIV，适用于AIV的检测、诊断和流行病学调查。

【原理】

      利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。

【试剂盒组份】

注：塑料袋内试剂（阳性对照、RT-PCR反应液A和B）-20 ℃冻存，裂解液2-8℃冷藏，其他室温保存。

【操作方法】

一、样品制备

1样品采集：病死或扑杀的禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理盐水中，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）

2样品处理：

2.1 组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取100 µL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。

2.2 全血样品的处理：待血凝后取100 µL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。

2.3 阳性对照的处理：取阳性对照 100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。

2.4 阴性对照的处理：取阴性对照100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。

二、病毒RNA的提取

1. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入450µL裂解液，充分颠倒混匀，室温静置3min 。

2. 加入275µL无水乙醇，轻轻混匀。

3. 将混合液吸入吸附柱中（吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），10,000 rpm 离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。

4. 向吸附柱中加入500µL洗涤液A，10,000 rpm 离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。

5. 向吸附柱中加入500µL洗涤液B，10,000 rpm 离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管。

6. 空柱10,000 rpm 离心2 min。

7. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在膜中央加入30µL洗脱液，室温静置2min，10,000 rpm 离心1min，获得总RNA。

三、RT-PCR

1. 反应体系：分别取14µL RT-PCR反应液A（用前混匀）、4µL RT-PCR反应液B（用前混匀）和2µL模板RNA，混匀。

2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

四、电泳

1. 制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。

2. 电泳：待胶凝固后，取5µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。

3. 染色：取50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。

【结果判断】

      阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为禽流感病毒阳性，否则为阴性。

【需用但未提供的材料】

      组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯（DEPC ）处理的灭菌1.5mL 离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）。

【注意事项】

1．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的组分不要混用。

2．所有试剂应在规定的温度储存，使用时拿到室温下，使用后立即放回。

3．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。

4．严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

5．RNA提取过程中，应戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。

6．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。

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