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高效液相色谱法在苯检测中的应用
一、标准起草背景
苯在各行业被广泛使用,制鞋和箱包工业中大量使用苯或含苯的溶剂和黏胶剂,在我国尚有此类企业存在空气苯严重超标的情况。
二、标准使用范围
本标准规定了尿中苯巯基尿酸浓度的检测方法,适用于职业接触苯工人尿中苯巯基尿酸浓度的测定。尿中苯巯基尿酸(SPMA)与苯接触者存在良好相关性,是低浓度苯接触特异和敏感的生物标志物。目前国外研究机构主要采用高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LCMS、LC-MS/MS)、气相色谱法(GC)、气质联用(GCMS)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法检测尿中SPMA。HPLC法是各国职业卫生机构进行生物监测的常用方法。目前国内高效液相色谱HPLC仪基本普及,利于其作为职业苯接触尿中SPMA检测方法的应用。本法所用仪器在基层单位已普及,方法前处理简单易操作,样品采集、运输、保存方便,色谱操作易于掌握,因此本方法便于推广应用。
三、标准制定的方法和依据
本方法原理是尿中苯巯基尿酸(S-phenylmercapturic acid, SPMA)经∶异丙醇(5∶1,v/v)液-液萃取后,经ODS柱分离,紫外检测器检测,以SPMA峰保留时间定性,峰高或峰面积定量。该方法选择乙腈-0.3%甲酸(25∶75,v/v)为流动相,0.3%甲酸可使SPMA色谱峰保留时间短,而且出峰附近没有杂质峰干扰。对SPMA全离子峰(扫描范围:100-300 m/z)可见SPMA分子离子峰([M-H]— m/z238)和一个碎片峰(m/z109),其中[M-H]—m/z238为基峰,将其作为定量分析检测的离子。该方法检测限为10µg/L;线性范围为10~320 µg/L。应用该方法对55名低浓度苯作业者的现场研究表明,个体接苯浓度的TWA范围为0.71~32.17mg/m3,尿中SPMA浓度范围为10~924µg/L,可满足10ppm以下苯接触人群生物监测的需要,特别对我国苯作业场所职业接触限值TWA =6mg/m3内的人群可进行有效生物监测与评价。
本方法用于测定尿中SPMA不足之处是保留时间较长,检测灵敏度较低,但仍可定量区分职业与非职业苯接触。本方法选用∶异丙醇(5∶1,v/v)萃取,实验表明混合溶剂萃取效率高。流动相选用乙腈作为流动相A,乙腈-甲醇-三乙胺(磷酸调节PH)为流动相B,采用梯度洗脱以缩短分析检测时间。柱温箱温度设置在35℃时,尿样中样品峰周围的杂质峰对SPMA出峰的影响*小,色谱峰分离较完全。方法选择205nm波长作为检测波长,可保证在基线平稳的状态下,既降低背景干扰、又提高检测的灵敏度。尿液PH对SPMA提取效果影响大,Paci[7]将尿样先加强酸后加碱液调节适宜pH值后用有机溶剂提取,其机制是尿中SPMA前体在酸性条件下可水解为SPMA;实验中发现尿样pH在1~2时,SPMA的提取回收率较高。
四、标准使用的说明
本方法样品进行前处理时,需要调节尿样使pH<2时,这时的SPMA的提取回收率较高。在实验过程中,在流动相B中,当调节三乙胺溶液的pH=2.16时,SPMA色谱峰的分离效果较好。将柱温箱的温度设置在35℃时,尿样中样品峰周围的杂质峰对SPMA出峰的影响*小。在低浓度苯接触时吸烟可能存在影响,采样前一天接触者应避免吸烟。需要注意的是,在中、高浓度的苯接触时,班后反-反式粘糠酸(ttMA)与空气苯浓度的相关性优于苯巯基尿酸(SPMA)。建议在接苯浓度5ppm以下时可尿SPMA为生物监测指标,在5ppm-15ppm尿ttMA,在15ppm以上时两项指标均可选择。
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原创作者:深圳市瑞盛科技有限公司