Super Fluor 488, 555, 647, 680, 750活化酯

Super Fluor活化酯（与Invitrogen的Alexa Fluor活化酯wan全相同）：

Super Flour 系列荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH 4～10）, 更好的抗淬灭性。在生物荧光域已逐渐替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等荧光染料。

表1  Super Fluor 488, 555, 647, 680, 750活化酯的性质参数

一、原料准备：

A．活性染料 1mg；B．碳酸氢钠 ～84mg；C．抗体纯化树脂P-30／Sephadex G25M／透析袋；D．空柱 5 个；E．收集管 5 个； 

注意：纯化的蛋白buffer 中不得含有铵离子或伯铵，因为它们会与蛋白质竞争结合活性染料。不纯的抗体或者含BSA 或明胶的抗体标记效果不好。低浓度的NaN₃（<3mM）或thimerosal（<1mM）不影响偶联效果。

活性染料稳定性与储存：未开封的粉末在避光干燥-20℃可存放6个月。其水溶液现配现用不能储存。任何溶解后的染料zui好立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存多2个星期。

一．实验步骤

1.1 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO₃ 溶解至终浓度为2mg/mL 

将1mL 去离子水加入84mg NaHCO₃ 瓶中，配成1M 的碳酸氢钠溶液。振荡或吹打至wan全溶解。该溶液pH 约8.3，2～6℃保存可用2个星期；若抗体是溶液，将抗体稀释至2mg/mL，再加入1/10 体积的上述碳酸氢钠溶液；若抗体是冻干粉，将1M 碳酸氢钠溶液用10 倍去离子水稀释成0.1M 后，用其将抗体溶成2mg/mL 的溶液。

1.2 染料溶解：染料固体粉末从冰箱放入干燥器中慢慢升至常温后，用无水DMSO将染料配置浓度为1 mg/mL。

1.3 标记：在1mL蛋白溶液中缓慢加入适量染料溶液，（蛋白:染料摩尔比=1:20～50；质量比可在以下范围内优化 10～200ug Super dye每毫克IgG抗体）。同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。也可以直接将蛋白溶液直接加入染料的固体粉末的试剂瓶中，同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。

1.4 纯化：选择下面三种方式纯化后，产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM 叠氮化钠溶液中，-20℃避光储存。

1.4.1 透析法：

1）简单纯化可用100 mL 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4次,每次4小时除去未标记上的染料。 

2）在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。  

3）用100 mL 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。 

4）用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

1.4.2 P-30柱子

1）0.5g p-30凝胶加入9mLPBS（pH=7.4）室温过夜放置；次日，弃上清；真空抽滤5min。

2）加入9mLPBS，轻柔震荡均匀，放置20min后，去除上清液。

3）再重复2）。

4）将树脂柱放入一个13×100mm 的玻璃管柱中，每个柱子加入1.5mL（不要多加），填的要均匀不能有气泡。具体方法是：搅动纯化树脂（组分C），加入1.0mL 悬浮液至空柱中静置；全部下沉后再加入0.5mL树脂至床体积为～1.5mL盖上盖子，可以室温保存。

5) 将树脂柱上下端的口打开，放入10mL离心管中由于重力水自然流下，用垂直转子1100g 离心3min，rpm 与相对离心力g 的换算公式如下：相对离心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半径cm)；离心后静置待缓冲液全部流出，弃去缓冲液，保留收集管（若没有垂直转子，角转子也可）。

6) 换上干净的离心管，将标记的蛋白反应液200μL逐滴加入树脂柱的中心部位，使溶液被吸入胶床中； 

7) 将树脂柱放入空的收集管中，1100g 离心5min；

8）离心后，收集管内是标记好的蛋白，溶在100μLPBS 中，pH7.2，包括2mM 的叠氮钠。未结合的染料保留在柱中，弃去树脂柱。

注意事项：配置柱子时，用较细的小瓶，每个小瓶配置2个柱子。便于去除水分。填柱子时，加到1.5mL，尽量不要多加，离心时间按照说明书1000g/3min，不要随便更改。

1.4.3 PD-10 column (Sephadex G25M)

1.4.3.1 装填柱层析分离吸附柱

1) 提用去离子水浸泡葡聚糖Sephadex过夜(1g 配5mLH₂O)，使其溶胀，打开孔状结构。

2) 湿法装柱：装填过程中确保PBS（10mM, pH=7.4）液面比Sephadex高，以防混入空气而产生气泡。先在柱子（13×100mm）内注入3/4左右的PBS，而后加入Sephadex /PBS溶液；分批次、缓慢加入柱子内，zui后用塑料滴管吸取，沿着柱子四壁旋转，逐步、缓慢地加入，装填至近满，留下约3cm的空间以待注入荧光标记蛋白溶液。

3) 在装填的整个过程中打开活塞（淋出液用大烧杯承接），同时用玻璃棒+橡胶塞从下到上轻轻敲打柱子，使Sephadex装填紧密，注意使柱子内不得有气泡，不得有断层，使柱子竖直，确保顶部端面水平；故滴加Sephadex时应旋转加入，不得直接滴加，以免激起柱顶层。

4) 装填完柱子后，用塑料滴管吸取PBS，沿管口四壁旋转着缓慢加入，使PBS过一遍柱子，而后将PBS注入Sephadex顶部，以隔绝空气，以免在柱内产生气泡，关闭末端活塞。

1.4.3.2 过柱层析分离吸附柱（避光）

1) 打开柱子末端活塞，缓慢放出柱子顶层的PBS，待PBS液面刚与Sephadex柱子端面相平时，立即关闭活塞；

注意：不要使PBS液面低于Sephadex柱子端面，以免混入空气而在柱子内产生气泡；立即用塑料滴管吸取荧光蛋白溶液，沿柱子四壁旋转，缓慢加入（全部加完）。不要搅动Sephadex ，随时保持其端面水平。

2) 待荧光蛋白溶液全部加完后，打开活塞，使荧光蛋白溶液流

入柱子中；当荧光蛋白溶液的液面刚刚wan全进入柱子时， 立  

即用塑料滴管加入PBS（缓慢沿管子四壁旋转加入），在荧

光蛋白溶液过柱子的过程中注意随时添加PBS，确保

Sephadex端面不与空气接触。

3) 用烧杯承接初的淋出液，几分钟后带颜色的溶液便从柱子    

顶部往下流，而后分作三段；

柱子下端（靠近活塞）：荧光标记的蛋白，带颜色，流速较快；

柱子中间：空白无颜色部分，两者的过渡区域；

柱子上端：未与蛋白反应的染料，带颜色，流速较慢。

4) 待下端带颜色的荧光蛋白溶液的沿进入活塞时，立即用5mL冻存管（锡箔纸避光）承接此淋出液（此即荧光蛋白溶液）；直至荧光蛋白溶液的尾部进入活塞口为止。

5）用10倍柱体积的PBS洗掉未反应的染料，使柱子再生后重复使用。长时间储存柱子可用含0.05％NaN₃的PBS溶液平衡柱子后，密闭封严在2～8℃储存。

1.5 贮存：标记好的蛋白贮存于2～6℃，避光。若纯化的蛋白偶联物浓度小于1mg/mL，加入BSA 或其他稳定蛋白1～10mg/mL。在2mM 叠氮钠存在的情况下，2～6 度可保存几个月。保存更长时间，则需分装后-20℃保存。避免反复冻融，避光保存。

二．计算标记比例F/P值：

对于IgG 等大多数抗体来说，摩尔吸光系数为203000，F/P值在4～9 之间是合适。

1. Super Flour 488标记蛋白F/P值计算：

1）用PBS 精que倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和494nm的光吸收；

2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A₂₈₀-(A₄₉₄×0.11))×稀释倍数/203000

3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A₄₉₄×稀释倍数/(71000×蛋白摩尔浓度)

2. Super Flour 555标记蛋白F/P值计算：

1）用PBS 精que倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和555nm的光吸收；

2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A₂₈₀-(A₅₅₅×0.08))×稀释倍数/203000

3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A₅₅₅×稀释倍数/(150000×蛋白摩尔浓度)

3. Super Flour 647标记蛋白F/P值计算：

1）用PBS 精que倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和650nm的光吸收；

2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A₂₈₀-(A₆₅₀×0.03))×稀释倍数/203000

3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A₆₅₀×稀释倍数/(239000×蛋白摩尔浓度)

4. Super Flour 680标记蛋白F/P值计算：

1）用PBS 精que倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和680nm的光吸收；

2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A₂₈₀-(A₆₅₀×0.05))×稀释倍数/203000

3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A₆₅₀×稀释倍数/(184000×蛋白摩尔浓度)

5. Super Flour 750标记蛋白F/P值计算：

1）用PBS 精que倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和750nm的光吸收；

2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A₂₈₀-(A₇₅₀×0.04))×稀释倍数/203000

3）计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A₇₅₀×稀释倍数/(240000×蛋白摩尔浓度)

三．常见问题：

1．标记效率低——计算结果显示每摩尔145,000 MW 的蛋白标记的荧光团少于4mol

有以下原因：

1）缓冲液中含有痕量伯铵成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液（如Tris或氨基乙酸），标记用PBS透析。

2）蛋白含量较低 (≤1 mg/mL)会影响标记效率。

3）标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率zui高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，加入重碳酸盐也无法将pH调节至适水平。要么加大重碳酸盐的量，要么将缓冲液换成PBS，或用0.1 M碳酸氢钠透析等。

4）研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度（只需10min）明显改善。

5）不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，因此标准步骤也不是总有zui好的标记结果。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。

2．过标记——计算结果显示每摩尔145,000 MW 的蛋白标记的荧光团大于10mol。虽然过标

记的蛋白也可以使用，但可能会引起蛋白的聚集、降低抗体结合抗原的特异性，这些都会造成非特异性结合。过标记还会引起荧光淬灭。可以增加蛋白或减少反应时间。

3．未结合染料难以去除——尽管大部分时候用分离柱可以较好的纯化蛋白偶联物，但仍可能会有痕量的游离染料留在偶联物溶液中，会使标记计算的值偏高。可用分离柱再次分离或透析去除。

4．蛋白或蛋白偶联物无法洗脱——不要再加缓冲液，只需再次离心一次或几次。

四．小动物活体成像域的应用

活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和沿的域，在研究细胞行为，药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进bu。分为生物发光成像（以Caliper和Xengon仪器为代表）和荧光成像（以KODAK和CRI仪器为代表）。

1. 荧光成像的推荐步骤：

1）SPF BALB/C裸鼠，6～8 周龄，18～20克，实验24 h 自由进食、饮水。

2）于实验裸鼠腹腔内注射2%戊巴比妥钠300μL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物zui好溶于水（或甲醇/乙醇/乙二醇，有时DMSO 200uL能把小鼠杀死）稀释后，于裸鼠尾静脉注射200μL（浓度0.5 mg/mL）[zui佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化]。每5min 记录1 张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。

对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。

3）Cy7 检测时激发波长700～770 nm带通，发射波长790 nm长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm，扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。

    不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4～6小时，快的只有30分钟；如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的Cy7标记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4小时以上，0%，20%，30%PBS蔗糖依次沉底，20μm切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。

2. 荧光成像常见问题

1）什么类型的小鼠适合活体成像？

   毛发对光有散射，建议用裸鼠。

2）给裸鼠注射的zui佳和da注射试剂体积？

   试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同，下面是体重25g的裸鼠注射量。

3）注射针头的尺寸是多少？

   推荐使用具有固定针头的28～32号结核菌素或胰岛素注射器（0.3或1mL）

4）肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体？

   推荐起始用量50µg来优化zui佳用量。

5）未标记的染料在老鼠体内如何代谢？

   未标记水溶性染料通过膀胱排泄，静脉注射后快能在3min检测到膀胱内的荧光信号。

6）注射后多长时间开始成像？

成像时间和成像持续时间与注射试剂有关。血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小时。注射标记的抗体IgG 到达靶点需要数小时，而后才成像并持续成像数天。

7）Super Fluor dyes的荧光寿命是多少？

Super Fluor 647在20°C水中τ＝1 ns

Super Fluor 680在20°C水中τ＝1.2 ns

Super Fluor 750在20°C水中τ＝0.7 ns

原创作者：上海瓦兰生物科技有限公司