AAV病毒包装流程盒注意事项

AAV（腺相关病毒）病毒包装是一个复杂而精细的过程，主要涉及多个步骤，包括质粒构建、细胞准备、质粒转染、病毒收集和纯化等。以下是对AAV病毒包装流程的详细概述：

一、AAV病毒包装的基本原理
AAV是一种小型无包膜病毒，属于细小病毒科，其基因组是一条单链线性DNA，约4700bp。AAV病毒系统通过目的基因替换掉Rep和Cap基因，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转，从而产生包含目的基因的AAV。

二、AAV病毒包装的具体流程
质粒构建
1：目的基因获取：先获取并验证目的基因。:

2：载体构建：将目的基因克隆至AAV载体中，构建AAV载体质粒。这一步通常通过酶切、连接、转化和测序等分子生物学技术完成。
3：质粒纯化：使用去内毒素质粒试剂盒抽提质粒，确保质粒浓度和纯度满足要求。

细胞准备
1：使用如AAV-293或HEK293T等包装细胞株，确保细胞生长状态良好，无支原体污染。

2：细胞传代至合适的密度（如80%~90%的汇合度）进行后续实验。

质粒转染
1：将AAV载体质粒、包装质粒（包含Rep和Cap基因）和辅助质粒按一定比例混合，使用转染试剂（如LipoFiterTM）转染至包装细胞中。

2：转染后6小时更换新鲜培养基，以促进细胞生长和病毒复制。

病毒收集和纯化
1：转染后72小时，收集细胞培养上清液，其中含有AAV病毒颗粒。

2：通过低温离心去除细胞碎片，加入核酸酶去除游离的核酸。

3：使用PEG8000/NaCl溶液进行病毒聚沉，然后用PBS重悬病毒颗粒。

4：进行密度梯度超速离心，进一步纯化病毒颗粒。

5：使用透析袋透析过夜，去除多余的PEG和盐分。

6：后，通过浓缩管进行浓缩和清洗，得到高纯度的AAV病毒悬液。

病毒质检
1：对AAV病毒进行滴度检测、纯度检测、无菌检测、支原体检测、内毒素检测等，确保病毒质量和安全性。

2：滴度检测通常采用qPCR方法，检测病毒颗粒中的基因组DNA拷贝数。

3：纯度检测则通过SDS-PAGE方法，观察病毒蛋白的组成和比例。

三、AAV病毒包装的注意事项:

1：实验操作应在生物安全柜内进行，确保无菌操作。

2：操作人员应穿戴实验服、口罩和手套，避免病毒污染。

3：病毒相关的废弃物需要特殊收集和处理，以防传播和感染。

四、AAV病毒包装的应用
AAV病毒因其宿主范围广、安全性高、免疫原性低等优点，已被广泛应用于基础研究和临床试验中。特别是在基因治疗域，AAV载体已成为常用的基因治疗载体。通过AAV病毒包装技术，可以将外源基因安全、高效地导入目标细胞或组织中，实现基因治疗的目的。