本试剂盒仅供科研使用
淀粉磷酸化酶活性测定说明书
(货号:WS0750W 微板法 48 样)
一、产品简介:
淀粉磷酸化酶是植物组织中降解淀粉的关键酶, 采用无机磷比色法测定淀粉
磷酸化酶活性。
二、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
三、试剂盒的组成和配制:
【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,避
免磷污染。
四、淀粉磷酸化酶活性检测:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实
验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min,取
上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 700nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。
② 在 EP 管中依次加入:
③ 显色反应:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
提取液 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用甩下使粉体落入底部,再
加 6mL 提取液后于 80℃水浴溶解
试剂二
粉体 mg ×1 瓶
-20℃保存
临用甩下使粉体落入底部,再
加 6mL 蒸馏水溶解
试剂三
液体 5mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
A:粉体 mg×1 瓶
B:液体 2mL×1 瓶
4℃保存
临用加 1.8mL 的 B 液,再加
23.2mL 的蒸馏水,混匀溶解备用。
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
试剂名称(μL)
测定管
对照管
试剂一
50
50
样本
50
试剂二
50
50
混匀,37℃孵育 20min
试剂三
50
50
样本
50
混匀,12000rpm,4℃离心 5min,上清液待测
上清液
50
50
试剂四
200
200本试剂盒仅供科研使用
2
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.6402x - 0.0034,x 是标准品摩尔质量(μmol/mL), y 是△A。
2、按蛋白浓度计算:
定义:每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0034)÷0.6402×V2] ÷(V1×Cpr)÷T
=18.74×(△A+0.0034)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
定义:每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2] ÷(W× V1÷V)÷T
=18.74×(△A+0.0034)÷W
V---加入提取液体积,1mL;
V1---加入样本体积,0.05mL ;
V2---酶促反应总体积,0.2mL;
T---反应时间,1/3 小时;
W---样本鲜重,g;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1
制备标准品母液(5μmol/mL):标准品用 10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2
把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整
标准品浓度。
3
依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。
混匀,室温静置 3min,700nm 下读取各管吸光值,
△A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。