本试剂盒仅供科研使用
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS0850W 微板法 48 样)
一、产品简介:
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)是一种水解酶,可以水解人们日常
饮食中常见的黄酮苷类化合物。该酶广泛分布于自然界的细菌和真菌等生物中。它在工业
上具有许多潜在的应用价值。
本试剂盒采用对硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR)作为底物,生成黄色的对硝基苯酚(PNP),
该产物在 405nm 处有大吸收峰。通过检测 PNP 在 405nm 下的增加速率,即可得到α-L-
鼠李糖苷酶活性的大小。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
临用甩几下或离心使试剂落
入底部,再加 1.1mL 蒸馏水溶
解混匀,若难溶解可超声溶解。
试剂二
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、恒温培养箱、研钵、蒸馏水。
四、α-L-鼠李糖苷酶活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,4℃×12000rpm 离心
15min,取上清液待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:可直接测定,或者适当稀释后测定。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min,调节波长为 405nm。
② 所有试剂于 40℃水浴中预热 20 min。
③ 在 96 孔板中依次加入下列试剂:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
10
10
试剂一
20
试剂二
70
90
迅速混匀,40℃保温 20min本试剂盒仅供科研使用
2
试剂三
100
100
混匀,5min 后立即于 405nm 下读取吸光值 A,ΔA=A
测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。
【注】:①若△A 的值非常低在零附近,可增加样本量 V1(如增至 20μL,则试剂二相应减少)或
延长反应时间 T(如增至 30min 或更长),则重新调整的 V1 和 T 须代入公式重新计算。
②若△A 的值超过 1,则需要稀释样本,稀释倍数 D 代入计算公式;
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 53.937x - 0.0037,x 是标准品(PNP)摩尔质量:μmol;y 是△A。
2、按照样本质量计算:
酶活定义:在 40℃下,每克组织每小时水解 1μmoLPNPR 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(W×V1÷V)÷T×D
=5.56×(△A +0.0037)÷W×D
3、按照样本蛋白浓度计算:
酶活定义:在 40℃下,每毫克蛋白每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(Cpr×V1)÷T×D
=5.56×(△A +0.0037)÷Cpr×D
4、按细胞数量计算:
酶活定义:在 40℃下,每 104个细胞每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/104 cell)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(500×V1)÷T×D
=0.011×(△A +0.0037)×D
5、按液体体积计算:
酶活定义:在 40℃下,每毫升液体每小时水解 1μmoLPNPP 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mL)= [(△A+0.0037)÷53.937]÷V1÷T×D =5.56×(△A +0.0037)
W---样品质量,g;
V---提取液体积,1 mL;
V1---上清液体积(mL),0.01mL;
T---反应时间,20 min=1/3h。
D---稀释倍数,未稀释即为 1;
Cpr---上清液蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1
制备标准品母液(10μmol /ml):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水溶解,若有结晶析出,需 37℃
水浴至完全溶解。
2
把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/ml。也可根据实际样本来调整标
准品浓度。
3
依据 10ul 的标准品+90ul 的试剂二,再加 100ul 的试剂三,于 405nm 处读值;根据结果即可制作
标准曲线。