本试剂盒仅供科研使用
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase, α-GC)试剂盒说明书
(货号:WS1250F 分光法 24 样)
一、产品简介:
α-葡萄糖苷酶(α-GC,EC 3.2.1.20) 又叫α-D-葡萄糖苷水解酶,广泛分布于动植物和微生物中,是一
类能够从含有α-糖苷键底物的非还原端催化水解 a-1,4-糖苷键,释放出葡萄糖,或将游离出的葡萄糖残基
转移到另一糖类底物形成α-1,6 糖苷键,从而得到低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等物质。α-葡萄糖苷酶与
淀粉及糖原等糖代谢密切相关,对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。
α-葡萄糖苷酶可以水解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 405nm 有大吸收峰,
通过测定吸光值升高速率来计算α-葡萄糖苷酶活性。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,再加
2.5mL 蒸馏水溶解,4℃保存。
试剂二
液体 8mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液体32mL×1瓶
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、
研钵、冰。
四、α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的样本取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴
匀浆。15000rpm, 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细
胞,加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,
间隔 10s,重复 30 次);15000 rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例
进行提取。
3
液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。
② 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
20
20
试剂一
80
蒸馏水
80
试剂二
100
100
迅速混匀,37℃保温 30min本试剂盒仅供科研使用
2
试剂三
600
600
混匀, 全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿中,405nm 处测定吸
光 A,ΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。
【注】若ΔA 较小,可以增加 37℃保温反应时间(如 1 小时),或者增加样本上样量(如增至 60μL,
则试剂二相应减少),则改变后的反应时间 T 或加样体积 V1 需重新代入计算公式计算。
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 0.0237x - 0.0206;x 是 PNP 摩尔质量(nmol),y 是△A。
2、按样本蛋白浓度计算:
定义:每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位。
α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷(V1×Cpr)÷T= 70.32×(ΔA+0.0206)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
定义:每克组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位。
α-GC 活性(nmol/min/g 鲜重)= [(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷(W×V1÷V)÷T=70.32×(ΔA+0.0206) ÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)为一个酶活性单位。
α-GC 活性(nmol/min/104cell) = [(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷(500×V1÷V)÷T =0.14×(ΔA+0.0206)
5、按液体体积计算:
定义:每毫升样本每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位。
α-GC 活性(nmol/min/mL)= [(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷V1÷T=70.32×(ΔA+0.0206)
V----加入提取液体积,1mL;
V1----加入反应体系中样本体积,20μL=0.02mL;
W----样本质量,g;
500----细胞或细菌总数,500 万;
T----反应时间,30min;
PNP 对分子质量----139.11;
Cpr----样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。
2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mg/mL。也可根据实际
样本来调整标准品浓度。
3 在 EP 管中依次加入:20μL 标准品+80μL 蒸馏水+100μL 试剂二+600μL 试剂三,混
匀,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿中,于 405nm 下读取吸光值。
4 根据结果制作标准曲线。