本试剂盒仅供科研使用
内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒说明书
(货号:WS3350W 微板法 96 样)
一、产品简介:
内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份
,这类酶随机水解β-1,4-糖苷键,将无定形长链纤维素分子截短,将其分解成葡萄糖、
纤维二糖、纤维三糖等各种类型的还原糖,在碱性条件下,产生的还原糖能与3,5-二硝基
水杨酸反应生成棕红色物质,该物质在540nm下有大吸收峰,即可得出内切-β-1,4-葡聚
糖酶的酶活性大小。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 110mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 32mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×1 瓶
4℃保存
临用加 16mL 试剂一,80℃水
浴,搅拌至溶解,仍 4℃保存。
试剂三
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织:称取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴
匀浆,4℃放置 10min;12000rpm,4℃离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中加入经
预冷的 80%乙醇混匀,4℃放置 10min;12000rpm,4℃离心 5min;弃上清,留沉淀。
再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液,涡旋混匀,4℃放置 10min;12000rpm,4℃离心
10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。
② 细菌/培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细
胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间
隔 10s,重复 30 次);12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500:1 比例进行提取。
③ 液体样本:若是澄清液体,直接检测,若液体样本浑浊,需 4℃×12000rpm,离心 10min,
取上清液检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
50
50
试剂一
150
试剂二
150
37℃孵育 60min
试剂三
150
150本试剂盒仅供科研使用
2
混匀,95℃水浴 5min,取出后用自来水或冰水冷却至室温,
取 200μL 澄清液体于 96 孔板中,在 540nm 处读取吸光值
A,ΔA=A 测定管-A 对照管(每个样本做一个对照管)。
【注】若ΔA 在零附近如低于 0.005,可增加样本取样质量 W 或增加样本加样体积 V1(如增至
80μL,
则试剂三相应减少),则改变后的 W 和 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程为 y = 0.0132x - 0.0545;x 为标准品质量(μg),y 为ΔA。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义:每毫克组织蛋白每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(Cpr×V1) ÷T
=1515.2×(ΔA+0.0545) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算
单位定义:每克组织每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(W×V1÷V) ÷T
=1515.2×(ΔA+0.0545)÷W
4、按细菌/细胞密度计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(500×V1÷V) ÷T
=3×(ΔA+0.0545)
5、按液体体积计算
单位定义:每毫升液体每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg /h/mL)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷V1÷T
=1515.2×(ΔA+0.0545)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.05 mL;
T---反应时间,60 min=1 小时;
W---样本质量,g;
500---细菌或细胞总数,500 万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(2mg/mL):从标准品管中称量取出 4mg 至一新 EP 管中,再加 2mL
蒸馏水混匀溶解即 2mg/mL 的葡萄糖(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可
根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据对照管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。