本试剂盒仅供科研使用
α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒说明书
(货号:WS3250F 分光法 24 样)
一、产品简介:
α-半乳糖苷酶(α-GAL,EC 3.2.1.22)可特异性地水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的
α-半乳糖苷键。在人、动物、植物、微生物体内均存在。在食品饲料和医药等域中有
着广泛的应用景。
本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法,α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半
乳糖苷生成黄色的对-硝基苯酚(PNP),后者在 405nm 有大吸收峰,通过测定吸光值
升高速率来计算α-GAL 活性。
二、测试盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用加 2ml 水。
试剂二
液体 8mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液 20mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂×1 支
4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、
研钵、冰。
四、α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,冰浴
匀浆,然后 12000rpm,4℃,离心 10min,取上清作为粗体液,置于冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细
胞,加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,
间隔 10s,重复 30 次);15000 rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,温度设定 37℃,波长设定为 405nm,蒸馏水调零。
② 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
20
20
试剂一
75
蒸馏水
75
试剂二
115
115
迅速混匀,37℃保温 30min本试剂盒仅供科研使用
2
试剂三
540
540
混匀,全部液体转移到 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中,405nm
处测定吸光值 A,ΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个
对照管)。
【注】:若ΔA 过小,可增加样本上样量 V1(如增至 60μL,则试剂三相应减少),或延长保
温时间(如:40min 或更长),则改变后的 V1 或 T 需重新代入计算公式计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.022x + 0.0045:x 是标准品 PNP 的质量(nmol),y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0045)÷0.022]÷(V1×Cpr)÷T=75.76×(ΔA-0.0045)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
单位定义:每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0045)÷0.022]÷(W×V1÷V)÷T=75.76×(ΔA-0.0045)÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0045)÷0.022]÷(500×V1÷V)÷T=0.152×(ΔA-0.0045)
5、按液体体积:
单位定义:每毫升液体每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位。
α-GAL 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0045)÷0.022]÷V1÷T=75.76×(ΔA-0.0045)
V---加入提取液体积,1mL;
V1---加入反应体系中样本体积,0.01mL;
W---样本质量,g;
T---反应时间,30min;
PNP 对分子质量---139.11;
500---细胞或细菌数量,万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。
2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/mL。也
可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 在 EP 管加入:20μL 标准品+75μL 蒸馏水+115μL 试剂二+540μL 试剂三,混匀,全
部液体转移到 1mL 玻璃比色皿中,于 405nm 下读取吸光值。
4 根据结果制作标准曲线。