本试剂盒仅供科研使用
锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)试剂盒说明书
(货号:WS4001F 分光法 48 样)
一、产品简介:
锰过氧化物酶(EC1.11.1.13,Mnp)是真菌分泌的一种糖基化的胞外蛋白,含亚铁血红
素的过氧化物酶,主要存在于引起白腐的木腐菌和土壤枯草菌这两个担子真菌中,属于木
质素降解酶系,能有效的降解木质素及废水和环境中其他一些抗性物质,如腐殖质酸和包
括多环芳烃在内的多种有机污染物等。
锰过氧化物酶(Mnp)在 Mn2+存在的条件下,将二甲氧基苯酚(DMP)氧化生成的产物
在 470nm 处有特征吸收峰。通过检测该产物在 470nm 处的增加速率,即可得到 Mnp 酶活
性大小。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×1 瓶
4℃保存
用甩几下使粉剂落入底部,再加
5mL 无水乙醇溶解备用。
试剂三
粉剂×1 瓶
4℃保存
用甩几下使粉剂落入底部,再加
3mL 蒸馏水充分溶解备用。
试剂四
液体×1 支
4℃保存
用甩几下使液体落入底部,取出
3µL 液体至新的 EP 管中,再加
1.5mL 蒸馏水混匀备用。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、天平、低温离心机、研钵、冰和蒸馏水。
四、锰过氧化物酶( Mnp)活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。
4℃×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 细菌或培养细胞:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取
液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
4℃×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照数量(104):提取液体积(mL)为 500-1000:1 的比例进行提取
③ 液体样本:若是澄清液体,直接检测,若液体样本浑浊,需 4℃×12000rpm,离心
10min,取上清液检测。
2、上机检测:
1 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 470nm,蒸馏水调零。
2 所有试剂至常温状态(25℃)。
3 在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中依次加入:本试剂盒仅供科研使用
2
试剂名称(µL)
测定管
样本
80
试剂一
580
试剂二
80
试剂三
40
试剂四
20
混匀,30℃条件下反应,10s 时读取
A1,10min 后读取 A2,△A=A2-A1。
【注】若△A 在零附近徘徊,可增加样本量(如增至 40µL,则试剂一相应减少),或延长反应
时间 T 至 15min 或更长,则改变后的样本 V1 和反应时间 T 需代入公司重新计算。
五、结果计算:
1.按照蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=18.2×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算:
酶活定义:每克样品每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性(nmol/min/g 鲜重)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=18.2×△A÷W
3.按照细胞数量计算:
酶活定义:每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性(nmol/min/104 cell)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(细胞数量×V1÷V)÷T
=18.2×ΔA÷细胞数量
4.按照液体体积计算:
酶活定义:每毫升液体每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性(nmol/min/mL)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=18.2×ΔA
ε---DMP 被氧化的产物的摩尔消光系数:55000L/mol/cm;
d---光径,1cm;
V---加入提取液体积,1mL;
V1---反应中样本体积,0.08mL;
V2---反应总体积,8×10-4 L;
W---样本质量,g;
T---反应时间,10min;
Cpr---样本蛋白浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。