本试剂盒仅供科研使用
细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒说明书
(货号:WS8150W 微板法 48 样)
一、产品简介:
蔗糖酶即蔗糖转化酶(Invertase,E.C.3.2.1.26)在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,是高等
植物蔗糖代谢关键酶。根据适 PH 值,蔗糖转化酶分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两
种类型,许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作一种转化酶。
AI 的适 pH 为 3.0~5.0,AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI(B-AI:cell-wall binding acid
invertase)两种类型,者分布在液泡中或细胞自由空间,后者存在于细胞间隙并结合在细胞壁上。B-AI
主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解,以维持库源之间蔗糖的浓度。
B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,经光谱
扫描在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液 A
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
提取液 B
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×1 瓶
4℃保存
用加入 7.5mL 试剂一充分溶解
备用;用不完的试剂 4℃保存;
试剂三
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 按照组织质量(g):提取液 A 体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,
加入 1mL 提取液 A),进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min,弃上清,留沉淀。
② 沉淀中加入 1mL 蒸馏水,震荡混匀,12000rpm4℃离心 10min,弃上清,留沉淀。
③ 沉淀中加入 1mL 提取液 B 充分混匀,4℃浸提过夜,12000 rpm 4℃离心 20min,取
上清置冰上待测。
2、上机检测:
1 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm。
② 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
40
40
试剂一
100
200
试剂二
100
混匀, 37℃准确水浴 20min 后,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧,
以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
试剂三
100
100
混匀,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧,以防止水分散失),流水冷本试剂盒仅供科研使用
2
却后充分混匀,吸取 200μL 转移至 96 孔板中,540nm 处读取吸光值
A,ΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。
【注】:1.若吸光值大于 1.5,可以用蒸馏水稀释样本后测定,计算公式中乘以相应稀释倍数 D。
2.若ΔA 值在零附近徘徊,可增加样本加样体积 V1(如增至 80μL,则试剂一相应减少),或延
长 37℃水浴时间(如增至 40min 或更长),则相应的 V1 和 T 需代入公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程为 y = 0.007x - 0.0234;x 为标准品质量(μg),y 为ΔA。
2、按蛋白浓度计算:
单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(V1×Cpr)÷T×D
=178.6×(ΔA+0.0234)÷Cpr×D
3、按鲜重计算:
单位定义:37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(W×V1÷V)÷T×D
=178.6×(ΔA+0.0234)÷W×D
V---加入提取液体积,1mL;
V1---加入反应体系中样本体积,0.04mL;
T---反应时间,20min;
W---样本鲜重,g。
D---稀释倍数,未稀释即为 1;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(5mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天
内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来
调整标准品浓度。
3 按照:40μL 标准品+200μL 试剂一+100μL 试剂三,依次加样操作,95℃水浴 10min,
冷却后,取 200μL 至 96 孔板中,540nm 下测定,根据结果即可制作标准曲线。