本试剂盒仅供科研使用
磷脂酶 D(Phospholipases D,PLD)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS5290W 微板法 48 样)
一、产品简介:
磷脂酶 D(EC 3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的
一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、
信号传导、生物膜形成的抗逆境胁迫等生理功能。
磷脂酶 D 催化水解底物 O-(4-硝基苯基)胆碱(NPPC),并在外加酸性磷酸酶的作用下产
生对硝基苯酚(PNP),该产物在 405nm 处有大吸收峰。通过检测 PNP 在 405nm 下的增加
速率,即可得到 PLC 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
用摇匀再用。
试剂一
粉剂 mg×2 支
-20℃保存
用甩几下或离心使粉剂落入底
部,每支加 0.3mL 蒸馏水溶解备
用。用不完的试剂-20℃保存。
试剂二
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
用甩几下使粉剂落入底部,加
2.4mL 蒸馏水溶解且 5000rpm 离
心 5min,取上清液备用。用不完
的上清液-20℃保存。
试剂三
液体 14mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体 2.5mL×1 支
4℃保存
标准品
粉剂×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、可调式移液器和蒸馏水。
四、磷脂酶 D(PLD)活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实
验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的果实样本可取 0.2-0.3g),加入 1mL 提取液(用
摇匀再用),进行冰浴匀浆,13000rpm,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细
胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,
重复 30 次);13000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min,调节波长到 405nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。
② 在 96 孔板中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
30
30
试剂一
10
试剂二
20
20本试剂盒仅供科研使用
2
试剂三
120
130
混匀,37℃孵育反应 30min。
试剂四
20
20
混匀,于 405nm 处读取吸光值 A,△A=A 测定-A 对照(每
个样本需做一个自身对照)。
【注】:① 若△A 的值小于 0.01,可增加样本量 V1(如增至 60μL,则试剂三相应减少)或延长反应时
间 T(如增至 60min 或更长),则改变后的 V1 和 T 须代入公式重新计算。
② 若△A 的值超过 1,可减少样本量 V1(如减至 10μL,则试剂三相应增加)或缩短反应时间
T(如减至 10min);或对终的待检液用蒸馏水稀释,则改变后的 V1 和 T 和稀释倍数 D
代入计算公式;
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 0.0576x - 0.0012,x 是 PNP 摩尔质量(nmol),y 是△A。
2、按照样本蛋白浓度计算:
酶活定义:37℃中每毫克蛋白每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
PLD (nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷(Cpr×V1)÷T×D=19.3×(ΔA+0.0012)÷Cpr×D
3、按照样本质量计算:
酶活定义:37℃中每克组织每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
PLD (nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷(W×V1÷V)÷T×D =19.3×(ΔA+0.0012)÷W×D
4、按细菌/细胞数量计算:
酶活定义:每 104个细胞每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
PLD (nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷(500×V1÷V)÷T×D=0.04×(ΔA+0.0012)×D
5、按液体体积计算:
酶活定义:37℃中每毫升液体每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。
PLD (nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷V1÷T×D=19.3×(ΔA+0.0012)×D
V---提取液体积,1 mL;
V1---加入反应体系中上清液体积(mL),0.03mL;
T---反应时间(min),30 min;
D---稀释倍数,未稀释即为 1;
W ---样品质量,g;
500---细胞数量;
Cpr---粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(10μmol/mL):向标准品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸馏水超声溶解。
2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 μmol/mL。也
可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 在 96 孔板中依次加入:30μL 标准品+150μL 试剂三+20μL 试剂四,混匀于 405nm 处
读值,根据结果即可制作标准曲线。