本试剂盒仅供科研使用
海藻糖-6 磷酸合成酶(TPS)试剂盒说明书
(货号:WS6550W 微板法 48 样)
一、产品简介:
海藻糖-6磷酸合成酶(TPS,EC 2.4.1.15)是海藻糖合成的关键酶,催化UDP-
葡萄糖和葡萄糖-6磷酸生成海藻糖-6磷酸和UDP。UDP与磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激
酶和乳酸脱氢酶的逐一作用下,使NADH氧化为NAD+,通过检测NADH在340nm处的
下降量来计算TPS的酶活力大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用甩几下或离心使粉剂落入底部,再
加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。
试剂二
液体 19mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用甩几下或离心使粉剂落入底部,再
加 1.5mL 蒸馏水溶解备用。
试剂四
粉剂 mg×4 支
-20℃保存
用甩几下或离心使粉剂落入底部,分
别加 0.3mL 蒸馏水溶解备用。用不完的
试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,
三天内用完。
试剂五
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
用甩几下或离心使粉剂落入底部,再
加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱/金属浴、可调式移液器、研钵、冰。
四、海藻糖-6磷酸合成酶(TPS)活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实
验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织样本,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心 10min,
取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
② 细菌/真菌样本:
先收集细菌或真菌到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取
液;冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复
30 次),室温晃动提取 30min, 8000rpm 室温(25℃)离心 10min,取上清。
【注】:若增加样本量,可按照提取液体积(mL) :细菌或真菌数量(104个)为 1:500~1000 的比例提取
2、上机检测:
1
酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm。
2 所有试剂解冻至室温(25℃)。
3
在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
20
20
试剂一
10本试剂盒仅供科研使用
2
试剂二
70
80
混匀,35℃孵育 30min 后,立即于 95-100℃煮沸 5min,
10000rpm,4℃离心 5min,上清液待测。
4
在 96 孔板中依次加入:
试剂二
110
110
试剂三
10
10
试剂四
10
10
试剂五
10
10
③的上清液
60
60
混匀,35℃下立即于 340nm 处读取各管吸光值 A1,
30min 后读取 A2。△A=(A1-A2)测定-(A1-A2)对照。
【注】 1.若△A 的值在零附近,可以适当延长③歩的反应时间到 60min 后或更长,改变后的反
应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量(如 40μL,则试剂二相应减少),
则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的样本)或ΔA 的值大于 0.4,可以适当减少
③的上清液加样量 V3(如减少至 40μL,则试剂二相应增加),则改变后的加样体积
V2 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算
单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
TPS 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V4÷(ε×d)×109] ×(V2÷V3) ÷(V1×Cpr) ÷T
=178.6×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位定义:每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
TPS 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V4÷(ε×d)×109] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T
=178.6×ΔA÷W
3、按细菌或真菌数量计算:
TPS 活力(μg/104cell)= [ΔA×V4÷(ε×d)×109]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T
=0.357×ΔA
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.02mL;
V2---第③歩的反应总体积,0.1mL;
V3---第④歩中所取上清液体积,0.06mL;
V4---反应体系总体积,2×10-4 L;
d---96 孔板光径,0.5cm;
ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; W---样本质量,g;
500---细菌或真菌总数,500 万;
T---反应时间,30min;
Cpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。