本试剂盒仅供科研使用
普鲁兰酶活性测定试剂盒说明书
(货号:WS8750F 分光法 48 样)
一、产品简介:
普鲁兰酶是一种水解酶,广泛存在于微生物及动物、植物体内,能一地分解淀粉和
糖原及其衍生物分枝点的α-1.6-葡萄糖昔键。它的这种特性早被用于淀粉结构的理论研
究,到七十年代,普鲁兰酶的应用已扩展到淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工
域,并逐步从实验室阶段走向工业化规模。
普鲁兰酶催化普鲁兰分解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色
氨基化合物,经光谱扫描在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收值与还
原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算普鲁兰酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 15mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×1 瓶
4℃保存
用甩几下使粉剂落入底部,再
加入 12mL 试剂一充分溶解备
用;用不完的试剂 4℃保存;
试剂三
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅、可调式移液
器、研钵、冰和蒸馏水。
四、普鲁兰酶活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称样本 0.1g(水分充足的样本可取 0.5g)于研钵中,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆后
转入离心管中。12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 液体样本:直接测定。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
1
可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。
② 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
20
20
(95℃煮沸 10min 的酶液)
试剂二
100
100
混匀,50℃孵育 30min
试剂三
100
100
混匀,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧,以防止水分散失),
流水冷却至室温。
蒸馏水
500
500
混匀,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中,于本试剂盒仅供科研使用
2
540nm 处读取吸光值 A,ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一
个自身对照)。
【注】:1.若 A 测定管的吸光值大于 2,可以用蒸馏水对整个显色混合液用蒸馏水进行稀释(如取
显色混合液 360μL 至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中,再加 360μL 蒸馏水,即稀
释 2 倍),则稀释倍数 D 需代入公式计算。或减少上清液体积 V1(如减至 10μL,则加
10μL 蒸馏水补齐),则 V1 需代入公式重新计算。
2.若ΔA 值在零附近徘徊,可增加样本加样体积 V1(如增至 40μL,则后蒸馏水体积相
应减少,保持反应总体积不变),或延长 50℃孵育时间 T(如增至 60min),则相应的 V1
和反应时间 T 需代入公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程为 y = 13.144x - 0.0644;x 为标准品质量(mg),y 为ΔA。
2、按蛋白浓度计算:
单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min /mg prot)=[(ΔA+0.0644)÷13.144×103]÷(V1×Cpr ) ÷T
=126.8×(ΔA+0.0644)÷Cpr
3、按鲜重计算:
单位定义:37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min /g 鲜重)=[(ΔA+0.0644)÷13.144×103]÷(W×V1÷V2) ÷T
=126.8×(ΔA+0.0644)÷W
4、按液体样本计算:
单位定义:37℃每毫升液体样本每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min /mL 液体)=[(ΔA+0.0644)÷13.144×103]÷V1 ÷T
=126.8×(ΔA+0.0644)
V---加入提取液体积,1mL;
V1---加入反应体系中样本体积,0.02mL;
T---反应时间,30min;
W---样本鲜重,g;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的蛋白含量(考马斯亮蓝法)试剂盒,不
建议使用蛋白含量(BCA 法) 试剂盒;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(5mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天
内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来
调整标准品浓度。
3 按照:20μL 标准品+100μL 蒸馏水+100μL 试剂三,95℃水浴 10min,冷却后,再加
500μL 蒸馏水,混匀,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中,540nm 下
测定,根据结果即可制作标准曲线。