本试剂盒仅供科研使用

甘油激酶（GK）活性测定试剂盒说明书

（货号：WS9190W微板法96样）

一、产品简介：

甘油激酶（GK，EC 2.7.1.30）是甘油代谢中的限速酶，催化甘油磷酸化产生3-磷酸甘

油，3-磷酸甘油在3-磷酸甘油脱氢酶的作用下产生磷酸二羟丙酮，进入糖酵解途径氧化分

解释放能量。该酶的缺乏将直接导致细胞不能利用甘油。

本试剂盒采用甘油激酶催化Mg-ATP依赖的甘油磷酸化为3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在

磷酸甘油氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢与显色剂反应在510nm处有大吸收

峰。通过测定510nm处的增加速率即可得出甘油激酶的酶活力大小。

二、试剂盒组成和配制：

试剂名称

规格

保存要求

备注

提取液

液体100mL×1瓶

4℃保存

试剂一

粉剂mg×1支

-20℃保存

用甩几下或离心使粉剂落入底

部，临用加1.1mL蒸馏水溶解

备用。用不完的试剂4℃保存。

试剂二

粉剂mg×1支

-20℃保存

用甩几下或离心使粉剂落入底

部，临用加1.1mL蒸馏水溶解

备用。用不完的试剂4℃保存。

试剂三

液体6mL×1瓶

4℃保存

试剂四

液体9mL×1瓶

4℃保存

试剂五

液体mL×1支

4℃保存

用甩几下或离心使试剂落入底

部，临用加2.2mL蒸馏水溶解

备用。用不完的试剂4℃保存。

标准品

液体1 mL×1支

4℃保存

若重新做标曲，则用到该试剂

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。

四、甘油激酶（GK）活性测定：

建议正式实验选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验

样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：取约0.1g组织（水分充足的样本可取0.5g）到研钵内，加入1mL提取液，

在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例提取）

② 细菌/真菌样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌/真菌加

入1mL提取液；冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间

隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：也可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例进行提取）

③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。

2、上机检测：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至510nm。

② 在96孔板中依次加入下列试剂：本试剂盒仅供科研使用

2

【注】：加完试剂五即启动反应，所以试剂五加完需立即混匀检测，若ΔA小于0.05，可增加样本上样量

V1，试剂四相应减少保持原体系不变（如样本上样量为20μL时，试剂四为80μL）；或延长反

应时间T（如延长至10min或更长），则改变后的V1和T需带入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、标准曲线：y = 0.1066x-0.0277：x为H2O2标准品浓度(μmoL/mL)，y为ΔA。

2、按样本鲜重计算：

酶活定义：每克组织每分钟催化生成1μmoLH2O2定义为一个酶活单位（U）。

GK(μmoL/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(W×V1÷V)÷T =1.88×(ΔA+0.0277)÷W

3、按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmoLH2O2定义为一个酶活单位（U）。

GK(μmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1.88×(ΔA+0.0277)÷Cpr

3、按细胞数量计算：

酶活定义：每104个细胞每分钟催化生成1μmoLH2O2定义为一个酶活单位（U）。

GK(μmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(500×V1÷V)÷T=0.004×(ΔA+0.0277)

4、按液体体积计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟催化生成1μmoLH2O2定义为一个酶活单位（U）。

GK(μmoL/min/mL)= [(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷V1÷T=1.88×(ΔA+0.0277)

V－－-加入提取液体积，1 mL；

V1－－-加入样本体积，0.01mL；

T－－-反应时间，5 min；

W－－-样本质量；

500－－-细胞数量；

Cpr－－-样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的蛋白含量测定试剂盒。

附：标准曲线制作过程：

1.用蒸馏水把母液（250mM）稀释成以下浓度梯度的标准品：0,2,4,6,8,10mM。也可根

据实际情况来调整标准品浓度。

2.按照测定管（样本替换为标准品）加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。

试剂名称（μL）

测定管

样本

10

试剂一

10

试剂二

10

试剂三

60

试剂四

90

混匀，37℃避光静止5min。

试剂五

20

混匀，37℃下，立即于510nm读取吸光值A1，避光孵育5min

后读取A2。ΔA=A2-A1。