本试剂盒仅供科研使用
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土壤中性磷酸酶(S-NP)试剂盒说明书
(货号:WS6030W 微板法 96 样)
一、产品简介:
土壤磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用,是评价土壤磷素生物转化方向和强度的
指标,也与土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 有一定的关系。
本试剂盒提供一种简单、灵敏、快速的检测方法。在中性环境中,土壤中性磷酸酶(S-NP)
催化磷酸对硝基苯酯(pNPP)生成黄色的产物 PNP,该产物在 405nm 处有大吸收峰。
通过检测 PNP 在 405nm 下的增加速率,即可得到土壤中性磷酸酶活性的大小。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
试剂一
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×2 瓶
4℃保存
每瓶临用加 10mL 试剂一充分溶解,
一周内用完。
试剂三
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、台式离心机、恒温培养箱、天平、可调式移液器、蒸馏水、甲苯。
四、土壤中性磷酸酶(S-NP)活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
取新鲜土样或干土(风干或者 37 度烘箱风干),先粗研磨,过 40 目筛网备用。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 405 nm。
② 在离心管中依次加入下列试剂:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
空白管
(只做一次)
土样
0.1g 鲜土或
0.05g 干土
0.1g 鲜土或
0.05g 干土
甲苯
10
10
10
试剂一
290
490
290
试剂二
200
200
混匀, 37℃(水浴锅或恒温培养箱)振荡反应 1h
试剂三
300
300
300
混匀,12000rpm 室温离心 10min,取 200μL 上清液转移至 96 孔
板中,于 405nm 下读取各管吸光值 A,△A=A 测定-A 对照-A 空
白(每个测定管需设一个对照管)。
【注】:1.后一步检测时,若有结晶析出,需要 37℃复溶再读取吸光值。
2.若ΔA 在零附近徘徊,可延长 37℃的孵育时间 T(如增至 4 小时或更长),或增加
土样质量 W(如增至 0.2g)。则改变后的 T 和 W 需代入计算公式重新计算。
3.若测定管 A 值大于 1.5 或△A 大于 1.5,可缩短 37℃的孵育时间 T(如减至 0.5 小时或更短)。本试剂盒仅供科研使用
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则改变后 T 需代入计算公式重新计算。或对后一步的待检测上清液(包括测定管、对照管
和空白管)同时用蒸馏水进行稀释,稀释倍数 D 代入计算公式。
4.若同时检测一大批同一背景下土壤样本(如都是黄土,黑土,红土,黄土等),可做三次样
本自身对照管(取平均值作为这批土壤样本的对照管),可从称样到检测步骤节省检测时间。
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 0.0139x + 0.0005;x 是 PNP 摩尔质量(nmol),y 是△A。
2、定义:每克土壤每小时水解 PNPP 产生 1nmol 对硝基苯酚(PNP)为一个酶活单位。
S-NP(nmol/h/g 土样)=[(△A-0.0005)÷0.0139]÷W÷T×D=71.9×(△A-0.0005)÷W×D
W---土壤样品质量,g;
D---稀释倍数,未稀释即为 1;
T---催化反应时间,1h;
PNP 相对分子质量---139.11。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(10μmoL/mL):向标准品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸馏水超声溶解,
若有结晶析出,需 37℃水浴至完全溶解。
2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 1.6, 3.2, 4.8, 6.4, 8 μmoL/mL。也
可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 在 EP 管中直接加入:10μL 标准品+490μL 试剂一+300μL 试剂三,混匀,取 200μL
至 96 孔板中,于 405nm 下读取吸光值。
4 根据结果制作标准曲线。