本试剂盒仅供科研使用
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土壤焦磷酸酶活性测定试剂盒说明书
(货号:WS9330F 分光法 24 样)
一、产品简介:
土壤焦磷酸酶(焦磷酸盐磷酸水解酶,EC 3.6.1.1)催化焦磷酸盐水解成正磷酸盐。在
土壤有机磷的矿化和转化中发挥重要作用。
本试剂盒提供一种简单、灵敏、快速的检测方法。土壤焦磷酸酶催化焦磷酸盐水解成
磷酸盐。可通过在 700nm 处测定生成的无机磷量来确定该酶活性大小。
二、试剂盒组分与配制:
【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,
避免磷污染。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、恒温培养箱、分析天
平、可调式移液器。
四、土壤焦磷酸酶活性测定:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实
验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
取新鲜土样或者 37 度烘箱风干(需先粗研磨),过 40 目筛网备用。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30 min,调节波长到 700 nm,蒸馏水调零。
② 反应 mix 制备:试剂四和五按照要求加蒸馏水溶解后,按试剂三:四:五=10:2:5
的比例依次混合配置(需现配现用,若出现蓝色则需弃掉重新配置)。
③ 在离心管中依次加入下列试剂:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
土壤样本(g)
0.1
0.1
试剂一
550
550
试剂二
50
混匀,37℃振荡培养 2 小时(间隔 30min 振荡混匀一次)
试剂三
300
300
试剂名称
规格
保存要求
备注
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉体 mg×1 支
4℃保存
用甩几下使试剂落入底部,再
加 3mL 蒸馏水,混匀溶解备用。
试剂三
液体 40mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
粉体 mg×1 支
4℃保存
临用甩几下使试剂落入底部,再
加 4.2mL 蒸馏水,混匀溶解备用。
试剂五
粉体 mg×7 支
4℃保存
临用甩几下使试剂落入底部,每
支再加 1.5mL 蒸馏水,混匀溶解
备用,现配现用。
标准品
粉体 1 mL×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用
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试剂二
50
立即混匀,于 12000rpm,室温或 4℃离心 5min,上清液
需立即测定,不可久置。
④ 显色反应,在 EP 管或 1mL 玻璃比色皿中依次加入:
上清液
200
200
反应 mix
600
600
混匀,室温静置 15min,于 700nm 处读取吸光值 A,
△A=A 测定-A 对照(参看注意事项)。
【注】:1. 若△A 的值在零附近,可延长孵育时间 T(如增至 5h)。
2. 若是同时检测同一背景下的土壤样本(如同一批样本不同时间点的取样),此批土壤样
本可做一个批次的样本自身对照,节省时间。
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 0.9007x - 0.0012;x 是标准品摩尔浓度(μmol/mL), y 是△A。
2、活性定义:在 37℃,每克土壤每小时水解 1μmol 焦磷酸产生 1μmol 无机磷定义为 1 个
酶活单位。
土壤焦磷酸酶(μmol/h/g 土样)=(△A+0.0012)÷0.9007×V1÷W÷T
=0.5×(△A+0.0012)÷W
V1---孵育阶段整个反应体积:900μL=0.9mL;
W---土壤样品质量,g;
T---催化反应时间,2 h;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(5μmoL/mL):标准品用 10mL 蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL。也可根
据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。