本试剂盒仅供科研使用
1
天冬酰胺合成酶(Asparagine Synthetase,AS)试剂盒说明书
(货号:WS9340F 分光法 48 样)
一、产品简介:
天冬酰胺合成酶(AS,EC 6.3.5.4) 广泛存在于植物和微生物体内,是一个以氨或谷氨酰
胺及天冬氨酸为底物催化合成天冬酰胺的关键酶,该酶对于研究植物营养有重要意义,
天冬酰胺合成酶(AS) 催化谷氨酰胺的氨基转移到天冬氨酸形成天冬酰胺,同时生成谷氨
酸;利用谷氨酸脱氢酶作用于生成的谷氨酸,同时使 NAD+还原成 NADH,通过测定 NADH
在 340nm 处的增加速率,进而得出天冬酰胺合成酶活性大小。
该酶催化反应:ATP+L-aspartate+L-glutamine+H2O=AMP+diphosphate+L-asparagine+L-glutamate。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,再
加入 6mL 蒸馏水溶解备用。
试剂二
粉体 mg×1 瓶
-20℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,再
加入 6mL 蒸馏水溶解备用。
试剂三
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,再
加入 6mL 蒸馏水溶解备用。
试剂四
粉体 mg×1 支
4℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,再
加入 3mL 蒸馏水溶解备用。
试剂五
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂六
液体 8mL×1 瓶
4℃保存
试剂七
粉体 mg×2 支
-20℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,每
支加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、台式离心机、水浴锅、可调式移液
器、研钵、冰和蒸馏水。
四、天冬酰胺合成酶(AS)活性检测:
建议正式实验选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
称取约 0.1g 组织(水分多的样本取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,
4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
② 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
150
150
试剂一
50
50
试剂二
50
50本试剂盒仅供科研使用
2
试剂三
50
50
试剂四
50
试剂五
250
300
混匀,37℃下孵育 20 分钟
95℃沸水浴 3 分钟,上下混匀后,12000rpm 离心 5 分钟,
上清液待测。
③ 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
②歩上清液
300
300
试剂五
300
300
试剂六
80
80
试剂七
20
20
混匀,37℃下孵育 20 分钟,全部液体转移至 1mL 石英比色皿
(光径 1cm)中,于 340nm 处读吸光值 A,
△A=A 测定-A 对照(每个样本需设一个自身对照)。
【注】若△A 差值在零附近,可在③反应阶段增加上清液(V3)的量(如增加到 400-500μL,
则试剂五相应减少);或延长第②歩中 37℃反应时间 T(如由 20min 增加至 40min);
或增加②歩中样本加样体积 V1(如由 150μL 增至 250μL,则试剂五相应减少);则
改变后的 V3 或 T 或 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmoL 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
AS(nmol NADH/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V4×109]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr) ÷T
=75×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
单位定义:每克组织每分钟生成 1nmoL 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
AS(nmol NADH /min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V4×109]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T
=75×ΔA÷W
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---②步中加入样本体积,0.15mL;
V2---②步反应体系总体积,6×10-4 L;
V3---③反应阶段中上清液,3×10-4 L;
V4---③步反应体系总体积,7×10-4 L;
d---光径,1cm;
ε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/moL/cm;
W---样本质量,g;
T---反应时间,20min;
Cpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。