因为神经干细胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潜能，因而，可以选用悬浮神经球培养的方法来获得和研讨。即将胚胎脑组织处理成单个细胞后，只有具有自我更新才能的细胞才能在培养液中克隆增殖成为悬浮的神经球，并随着传代的进行，坚持增殖才能和向多种神经子代细胞分化的才能。

    一.神经干细胞的分别和传代

    无菌条件下取重生SD大鼠(出世48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分别海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分别制造单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔参加细胞悬液500μl。待神经球构成后再次机械分别克隆制造单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔参加细胞悬液500μl。尔后每7d机械分别克隆传代1次，方法同前。
 
    二、BrdU符号

    将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后参加神经球构成后再次机械分别克隆制造的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球构成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
 
    三、神经干细胞的诱导分化

    选取部分上述传代后构成的次代神经球栽培于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并参加有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球持续培养，调查其生长分化情况。另将一部分次代神经球机械分别制成单细胞悬液后参加有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。
 
    四、条件培养液的制备

    取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，参加9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。
 
    五、神经干细胞的定向诱导分化

    将一部分次代神经球机械分别制成单细胞悬液后分别参加条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChAT免疫细胞化学染色。

原创作者：上海恒远生物科技有限公司