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恒远生物|细菌和真菌的DNA如何提取呢？
点击次数：12290 发布时间：2023/6/28 17:41:43
操作步骤：
1. 准备：无水乙醇、异丙醇、PBS 及 1.5mL 离心管。
2. 取出洗涤液，按终浓度 70%比例加入无水乙醇，如7.8mL 加入18.2mL 无水乙醇，充分混匀。
3. 菌体处理：将收集的细菌或真菌 5,000 rpm 离心3分钟，弃上清，加入 200μLPBS，振荡混匀，5,000 rpm 离心3分钟，充分弃上清。
4. 加入100 μL 裂解液Ⅰ，强烈 Vortex，直到沉淀悬浮，无明显块状沉淀，再加入裂解酶 10μL，充分混匀，室温放置 20 分钟。
5. 加入200 μL 裂解液Ⅱ，20μL 复合消化液，充分混匀，65℃孵育 20 分钟。
6. 加入450μL 异丙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响 DNA 的提取与后续实验。
7. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液全部转入吸附柱内，12,000 rpm 离心1分钟，弃收集管内废液。
8. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液至吸附柱内，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。
9. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。同时，按每份样本 40μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 400μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。
10. 将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。
11. 取出吸附柱，放入新的 1.5mL离心管内，加入上述预热的40μL 洗脱液，静置 2 分钟，12,000rpm离心 2 分钟，收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项：
1. 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时请就医。
2. 洗涤液尽量现用现配，按需计算用量后配制。加入乙醇后的洗涤液如使用不完，2-8℃密封保存不超过 1 周。
3. 细菌量建议不高于 10^7 。
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原创作者：上海恒远生物科技有限公司
