恒远文献：高糖对大鼠腹膜间皮细胞分泌细胞因子的影响及苦参碱的干预作用_资料下载

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恒远文献：高糖对大鼠腹膜间皮细胞分泌细胞因子的影响及苦参碱的干预作用

点击次数： 509发布时间：2011/3/7

上传者： shhybio
上传时间： 2019/12/6 10:24:12
文件大小： 291KB
文件类型： pdf
所属分类：论文
下载次数： 40次
查看次数： 509

资料简介：

高糖对大鼠腹膜间皮细胞分泌细胞因子的影响及苦参碱的干预作用
朱士彦１，甘平２，廖彧１，巫建芳１，龙贵华１
（１．广东省佛山市顺德区龙江医院肾内科５２８３１８；２．贵阳医学院附属
医院肾内科，贵阳５１００００）

［摘要］目的研究高糖刺激下大鼠腹膜间皮细胞分泌肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）和转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）及苦参碱的干预作用，探讨腹膜纤维化发生机制。方法通过体外培养大鼠腹膜间皮细胞（ＰＭＣｓ），依据加入药物浓度分成５组：２．５％葡萄糖组（ｎ＝１５，Ａ组）；低糖苦参碱组（２．５％葡萄糖，ｎ＝１５，Ｂ组）；４．２５％葡萄糖组（ｎ＝１５，Ｃ组）；高糖苦参碱组（４．２５％葡萄糖，ｎ＝１５，Ｄ组）；对照组（ｎ＝１５，Ｅ组，仅加不含血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２ＢＭＳＣ培养基），分别于第２４、４８、７２小时收集培养上清液，采用ＥＬＩＳＡ法测定各组培养上清液中ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１浓度的变化，同时观察各组大鼠腹膜间皮细胞光镜下的表现。结果光镜下，可见Ｅ组和Ｂ组腹膜间皮细胞小，呈卵圆形或圆形，生长较为密集。Ａ、Ｃ、Ｄ组腹膜间皮细胞大、呈梭形或多边形，分布较为稀疏；在Ａ组，培养上清液中ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１水平较Ｅ组无明显统计学变化（Ｐ＞０．０５）；而在Ｃ组，培养上清液中ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１水平较Ｅ组增加明显，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。在Ｂ组和Ｄ组中，ＰＭＣｓ分泌ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１水平Ｂ组较Ａ组减少，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；Ｄ组较Ｃ组明显下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论苦参碱能拮抗高糖致大鼠腹膜间皮细胞分泌ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１，从而保护腹膜间皮细胞。

［关键词］葡萄糖；苦参碱；肿瘤坏死因子α；转化生长因子β１；腹膜间皮细胞

腹膜透析（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｄｉａｌｙｓｉｓ，ＰＤ）由于自身生物相容性好，中分子物质清除效率高等优点，成为目前终末期肾脏疾病的透析方式。但是反复发作腹膜炎症可使有效腹膜透析面积减少，从而导致腹膜对溶质的清除及水分的超滤功能减退甚至功能衰竭，是部分ＰＤ患者改行血液透析治疗的主要原因［１］。实验表明，腹膜长期处于高渗微环境，可*终破坏腹膜的整体结构性，葡萄糖及其与机体产生的炎变产物是致ＰＤ相关性腹膜超滤衰竭重要原因［２－３］。如何从病理生理学机制方面深入探究腹膜超滤衰竭的发病机理，成为近年来医学研究的重要课题内容。现有研究证实人腹膜间皮细胞（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＰＭＣｓ）具有多重重要的生理功能，如分泌、吸收、修复、支持等。在腹膜发生炎变时，ＰＭＣｓ自身分泌的炎性因子和细胞因子，又影响到腹膜自身的修复［４－５］。本研究旨在探讨高糖致大鼠ＰＭＣｓ分泌肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）和转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）及苦参碱的抗纤维化作用，为临床防治腹膜纤维化，延缓病人的生命，有着极其重要的现实意义。
１材料与方法
１．１材料选取健康ＢＡＬＢ／ｃ大鼠３５只，雌雄兼用，体重１００～１２０ｇ，同等条件下饲养，鼠龄６～８周，由贵阳医学院动物实验中心提供。
１．２主要试剂胎牛血清（ＦＣＳ），ＤＭＥＭ－Ｆ１２ＢＭＳＣ培养基，胰蛋白酶液，卵母细胞裂解液，ＤＡＢ显色剂（编号ＡＲ１０２２），抗体稀释液（编号ＡＲ１０１６），Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液，多聚赖氨酸，枸橼酸盐缓冲液，以上均购自郑州益康生物工程有限公司；ＴＮＦ－αＥＬＩＳＡ试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，编号：ＡＲ２０５３）；ＴＧＦ－β１ＥＬＩＳＡ试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，编号：ＡＲ２０９５）；即用型ＳＡＢＣ免疫组化染色试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，编号：ＳＡ１０２０）；兔抗人细胞角蛋白１８抗体、抗人波形蛋白（上海联硕生物科技有限公司）；兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗体（上海联硕生物科技有限公司）；２．５％、４．２５％腹膜透析液２Ｌ（广州百特公司）；苦参碱注射液，每支１５０ｍｇ（１０ｍＬ），山西振东泰盛制药有限公司，批号Ｈ２００５９３３５。
１．３主要仪器ＨＷ－０８Ｃ型超级微量恒温器（上海旦鼎国际贸易有限公司）；倒置显微镜和光学显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）；无菌操作台（苏州江东精密仪器有限公司）；流式细胞仪（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）；凝胶成像分析仪（ＵＶＩ，英国）；ＤＮＭ－９６０２Ａ酶标仪（上海圣科仪器设备有限公司）。
１．４方法
１．４．１ＰＭＣｓ分离和体外培养每次取大鼠１只，直接心脏注射２ｍＬ左右１０％水合氯醛后处死，将大鼠置于工作台上，圆针固定四肢，先后用０．２２％聚维酮碘液、７５％的乙醇充分消毒胸腹部皮肤，用镊子提起中线腹部皮肤，持剪刀自下向上剪开皮肤及皮下组织，暴露腹腔，用小眼科剪小心剔除壁层腹膜组织。将获取的腹膜组织剪成２～４ｍｍ２的小块，置于Ｈａｎｋｓ混悬液中，自然沉淀后，再将组织块放入含１５０ｍＬ／ＬＮＢＳ的ＤＭＥＭ－Ｆ１２ＢＭＳＣ培养基中，随后移入培养瓶内，置于３７ ℃，５％ＣＯ２培养箱内慢慢培养。*初３ｄ内每天需更换培养液１次，培养４ｄ后每周更换培养液２次。约１５～１８ｄ组织块边缘新增殖的细胞逐渐铺开直至完全融合时，用免疫组化方法对细胞进行抗原抗体检测，鉴定为ＰＭＣｓ后，进一步行细胞因子测定［６］。
１．４．２分组及ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１的测定细胞完全融合后，以每毫升１０５个接种于９６孔培养板，待细胞铺满培养板，在不含血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２ＢＭＳＣ培养基中分别加入２．５％、４．２５％葡萄糖腹透液和苦参碱溶液，依据药物浓度分设５组，每组分为１５个复孔，每孔各加６５０μＬ：２．５％葡萄糖组（ｎ＝１５，Ａ）；低糖苦参碱组（２．５％葡萄糖，ｎ＝１５，Ｂ）；４．２５％葡萄糖组（ｎ＝１５，Ｃ）；高糖苦参碱组（４．２５％葡萄糖，ｎ＝１５，Ｄ）；对照组（ｎ＝１５，Ｅ，仅加不含血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２ＢＭＳＣ培养基）。用药前抽吸苦参碱１００ｍｇ分别与２．５％、４．２５％透析液２Ｌ配成浓度为５．０％的溶液。分别于培养后第２４、４８、７２小时收集培养上清液，采用ＥＬＩＳＡ法测定上清液中ＴＮＦ－α和ＴＧＦ－β１的浓度，具体操作步骤按试剂盒上说明书进行。
１．５统计学处理使用ＳＰＳＳ１１．５统计学软件进行分析，计量资料以ｘ±ｓ表示，各组间差异性比较采用单因素方差分析和ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
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