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恒远文献：茶多酚对紫外线诱导大鼠晶状体上皮细胞中 Caveolin-1
点击次数： 469发布时间：2011/3/7
- 上 传 者： 上海恒远生物科技有限公司
- 上传时间： 2019/12/27 9:50:03
- 文件大小： 224KB
- 文件类型： pdf
- 所属分类： 论文
- 下载次数： 47次
- 查看次数： 469
资料简介：
表达的影响
修鑫鑫，刘 丹
作者单位: ( 121001) 中国辽宁省锦州市，辽宁医学院附属医
院眼科
作者简介: 修鑫鑫，硕士，研究方向: 白内障发病机制和防治。
通讯作者: 刘丹，硕士，教授，主任医师，主任，研究方向: 白内障
发病机制和防治． yankeliudan@ yahoo． com． cn
关键词: 茶多酚; 紫外线; 晶状体上皮细胞; 小窝蛋白-1
修鑫鑫，刘丹． 茶多酚对紫外线诱导大鼠晶状体上皮细胞中Caveolin-1 表达的影响． 眼科杂志 2011; 11( 11) : 1886-18890 引言紫外线辐射与白内障的形成关系密切，但紫外线辐射导致白内障的发病机制目前仍众说纷纭。多数学者认为紫外线对晶状体的损伤机制多与氧化作用有关，氧化损伤是白内障形成的一个重要因素，也是紫外线辐射致晶状体混浊的主要机制［1］。小窝( Caveolae) 是脂筏中*重要的一种类型，小窝蛋白( Caveolin) 是 Caveolae 特异性标志蛋白［2，3］，在晶状体上皮细胞遭受氧化应激时保护细胞免遭氧化损伤等方面发挥关键作用［4］。本实验使用强氧化剂茶多酚( tea polyphenols，TP) 对紫外线诱导的晶状体上皮细胞进行干预，检测晶状体上皮细胞中 Caveolin-1 表达的变化，研究不同浓度 TP 对紫外线诱导的晶状体上皮细胞中 Caveolin-1 表达的影响，探讨 TP 抗氧化损伤作用，为氧化损伤性白内障的防治寻找新的理论依据和途径。
1 材料和方法
1． 1 材料 正常成年 SD 大鼠 96 只，体质量 200 ～ 250g，雌雄兼用，健康无眼疾( 购自辽宁医学院实验动物中心) 。
主要试剂和仪器: TP( 纯度 99． 9% ，上海恒远生物科技有限公司) 、兔 抗 鼠 Caveolin-1 多 克 隆 抗 体 ( Lab Vision 公
司) 、MEM 培养液( Hyclone 公司) 、小牛血清( Hyclone 公司) 、SP 免疫组织化学试剂盒、DAB 显色试剂盒、UV 光源
( 为 UV-A、UV-B 混合光源) 、CO2 培养箱、超净工作台、倒置显微镜( 日本 Olympus 公司，IX70 型) 、图像分析系统、
水平电泳仪、GelDoc1000 凝胶成像系统。
1． 2 方法 将大鼠颈椎脱臼处死后立即摘除双眼球，无菌无损伤条件下剥离晶状体，放入每孔盛有10mL MEM 培养液( 含 100mL/L 小牛血清、青霉素 105U/L、链霉素 0． 1g /L)的 12 孔培养板内，置 37℃，95% 湿度、50mL /L CO2孵箱中
培养 8h( 取透明晶状体用于实验，以排除手术损伤或其它原因所致晶状体混浊的可能性) 。将筛选出的晶状体随机分 6 组: 空白对照组、紫外线照射组和实验组，实验组按TP 的浓度分为 4 个亚组，分别为: 0． 02，0． 2，2 和 20mg /L。每组每个时间点随机选取 4 个晶状体，放入已经加过培养液的 12 孔板中，每孔一个晶状体。各实验组于紫外线照射前 2h 加药，常规培养。紫外线照射组和实验组，参照Dovrat 等［5］与 Zigman 等［6］法将晶状体置于垂直光源下方50cm 处，撤去培养板盖，晶状体表面上液保留约 1mm，其余培养液移走照射 30min，空白对照组置于同室同条件下无 UV 辐射处，再将 6 组标本同时放入培养箱中培养，分别在加入培养液后于 6，12，24 和 48h 时，停止孵育，取标本进行检测。
1． 2． 1 形态学观察 在白色背景下设置一宽 1mm，间距10mm 的垂直交叉的黑色线条，将孵育 6，12，24 和 48h 的
各组晶状体置于“+ ”字交叉的黑色线条背景之上照相，并观 察 晶 状 体 混 浊 程 度，将 照 片 导 入 电 脑，用 AdobePhotoshop 软件分析图像中每个交叉点的灰度和邻近交叉点的白色背景灰度，两者之差即为相对灰度值，对各组晶状体相对灰度值进行统计学分析。
1． 2． 2 免疫组织化学检查 用免疫组织化学法检测晶状体上皮细胞中 Caveolin-1 的表达情况，步骤按 SP 试剂盒说明操作，光学显微镜观察。阳性表达为细胞膜和/或细胞质有呈棕黄色的颗粒。每组不同时间点每个晶状体标本选 3 张切片，400 倍光学显微镜下，每张切片随机观察 5个视野，并记录阳性细胞率。阳性细胞率 = 5 个视野内阳性细胞总数/ 5 个视野内细胞总数 × 100% 。阳性细胞率0% 为 表 达 阴 性( -) ; 1% ～ 25% 为 弱 阳 性( + ) ; 26% ～50% 为阳性( + + ) ; ＞ 50% 为强阳性( + + + ) 。
1． 2． 3 Western-blot 免疫印迹法 取冻存晶状体前囊膜研磨成粉末( 每组每个时间点各取 3 只) 放入管中，加入0． 2mL 预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 含 0． 1mol /L磷酸缓冲液 pH7． 4 和 0． 1mol /L NaCl) ，匀浆，将匀浆液转移至离心管中，在 4℃，13 000r/min 下离心 20min。样品制备: 取 90μL 晶状体匀浆的上清液与等体积的加样缓冲液混匀，100℃ 加热 15min，-80℃ 贮存。样品制备后用 BioRad DC 蛋白质检测法蛋白定量，然后加入上样缓冲液煮沸 10min，12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，取空白对照组、紫外线照射组、4 个实验组各 1 个样本，每孔槽内确保可加样品的蛋白总量相等，以蛋白质低相对分子质量 Marker 作为参照。正常对照组样本可多次加样以作标准参考。电泳完毕后蛋白转移至硝酸纤维素滤膜，50g /L 脱脂奶粉封闭液封闭膜，然后用兔抗鼠多克隆抗体 Caveolin-1 作用过夜，PBS 液洗脱后，与羊抗鼠 IgG-过氧化物酶二抗结合，洗膜，ECL 显影成像。显影后将所得蛋白质条带用 Quantityone 软件进行定量分析。统计学分析: 采用 SPSS 17． 0 统计学软件包对数据进行统计分析，统计方法采用秩和检验和单因素方差分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
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