细胞集落形成实验

非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。

目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。

集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%

（一）原理

细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。

（二）实验用品

1.材料：Hela细胞。

2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。

3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。

（三）方法

1.平板克隆形成试验

本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。

（1）对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。

（2）细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。

（3）根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。

（4）培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。

（5）当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

2.软琼脂集落形成试验

本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。

（1）同上（1）~（3）步骤。

（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。

（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。

（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度（按照每皿含50、100、200个）的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。

（四）实验结果

1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。

2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：

集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100

（五）注意事项

1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌（ 10磅 15分钟）后按一次用量进行分装。

2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。

3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ，以免烫伤细胞。

4.接种细胞密度不宜过高。

5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。

（六）复习思考题

比较平板克隆形成试验和软琼脂集落形成试验的异同。

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