恒远：NK细胞介导的细胞溶解作用的研究

参考文献  

上海恒远生物科技有限公司是国内首批进口elisa试剂盒经销商，主要做的产品有生物试剂，血清，标准品，培养基，elisa试剂盒，劲马公司是国内众多大型企业以及医院的产品供应商，为了迎接中秋和国庆节，从即日日产品一律八折出售，给购买产品的客户提供免费代测的服务，欢迎前来购买和咨询。

前言

自然杀伤细胞（Nature Killer Cells, NK）是骨髓衍化的淋巴细胞，其*初通过巨大的颗粒性状被识别。NK细胞能自发杀灭多种肿瘤细胞，同时还可保护正常的细胞，从而被认为是癌症的克星。*重要的是，不管是在胞内还是胞外，NK细胞不需要免疫接种或提前激活，就能够自发溶解特定的肿瘤靶细胞，而T细胞必须要通过抗原递呈细胞的协助才能发挥作用。许多胞内外的实验表明, 除了外渗出和渗入肿瘤组织的能力外，NK细胞还有望具有抗肿瘤的能力。研究发现缺失NK细胞的小鼠在致癌物诱下更容易发产生癌症。另外，缺乏NK细胞的小鼠会持续遭受病毒感染，并很快死亡。很多疾病的发生会伴随NK细胞失控或出现不正常反应，包括移植排斥，糖尿病，各种自身免疫和神经性疾病,再生障碍性贫血或白血球减少症。因此，NK细胞在决定各生理状态和疾病状态中起着举足轻重的作用。同时， 监测NK细胞的细胞溶解活性，不仅可应用于监视癌症、传染病和自身免疫性疾病的免疫活性，而且可应用于搜寻介导细胞溶解效应的蛋白。

测量NK细胞溶解活性的传统标准方法是用⁵¹Cr或¹¹¹In进行放射性标记分析。

在这些分析中，靶细胞被放射性标记，然后与效应细胞混合。在给定时间内（低于四小时）检测放射性同位素的释放（与NK细胞介导的细胞溶解有关）。也可以使用一些非放射性标记方法进行检测，包括流式细胞术，基于ELISA的颗粒酶测量，及利用显微镜进行形态学分析3。

由ACEA 公司及罗氏应用科学部共同开发的实时无标记细胞分析系统xCELLigence，使动态监测NK细胞介导的细胞溶解成为可能。xCELLigence基于阻抗技术（RT-CES®）^4,5，贴附于E-Plate的96孔板孔中的细胞，其贴壁能力及相互作用都会导致阻抗发生变化，同时，阻抗的变化与贴壁细胞的数量，大小，形状变化都有关系。相反，向板孔中加入悬浮细胞，因为其不与检测板电阻接触或者只是微弱接触，所以不引起电阻抗变化。因此，NK细胞介导的单层癌细胞细胞溶解效应，可在E-Plate上进行动态的定量监测，而无需对靶细胞进行额外的标记。

材料和方法

细胞

NK 92, NIH 3T3细胞以及试验中用到的所有的癌细胞均购自ATCC，小鼠NK细胞（mNK）由Louisville大学Hui Shao博士提供。所有的细胞均培养在5% CO2，37°C的培养箱中，NK92和mNK细胞在含有2 mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，0.2 mM肌醇，0.1 mM ，0.02 mM叶酸，12.5%马血清，12.5% FBS，100-200 U/ml IL-2重组体的Alpha MEM培养基中培养。其它癌细胞培养在含有5% FBS，1%青霉素，1%螺旋霉素（GIBCO）的RPMI培养基中。NIH 3T3细胞培养在含有10%FBS，1%青霉素，和1%螺旋霉素的DMEM培养基中。

细胞溶解分析

靶细胞接种于96孔E-Plates上，每孔100 μl培养基。使用xCELLigence系统动态监测细胞直到对数期，此时形成了一细胞层（24-34小时，根据实验）。不同浓度的效应细胞直接加入到含有靶细胞的各孔中，效应细胞加入到不含靶细胞的孔作为对照。加入效应细胞后，每隔15分钟记录一次测量结果，连续记录20小时。

细胞形态镜检分析

使用Nikon直立显微镜观察NK细胞介导的细胞溶解效应。加入效应细胞后，当细胞指数（Cell Index）相比对照下降到50%时，取出细胞用80%的甲醇固定5分钟，使用Giemsa染色。镜检细胞形态学并用CCD相机进行记录。

实验数据分析

应用xCELLigence系统自带的软件，可对实验全过程，即从接种到细胞溶解，进行显示。通过实时显示时间-E/T（效应细胞与靶细胞比值）的依赖性曲线，可动态监测NK细胞的活性。xCELLigence系统使用细胞指数（Cell Index）表示细胞阻抗。每点的CI值定义为（Rn-Rb）/15，其中Rn表示孔含细胞时的电极阻抗值，Rb是表示孔中只含培养基时的背景阻抗值。

为了对特定点细胞溶解进行定量，通过与对照的参比，特定E/T比率下的细胞溶解百分比以Excel形式输出。

结果和讨论

动态检测NK细胞介导的细胞溶解

利用鼠NK细胞（mNK ）及靶细胞NIH 3T3细胞来监测NK细胞介导的细胞溶解活性。在96孔E-Plates板的每孔中接种5,000个NIH3T3细胞作为靶细胞，xCELLigence系统每小时记录生长数据，直到34小时后细胞达到生长期。鼠NK细胞作为效应细胞，以不同的E/T比例直接加入到孔中，动态监测NK细胞介导的细胞溶解过程。如图1A所示，与对照相比，当加入的mNK细胞E/T为15/1的时候，NIH 3T3细胞的细胞指数出现明显的下降。而在效应对照孔中加入YAC细胞（无细胞溶解效应的T细胞），细胞指数没有出现明显的下降。这表明细胞指数的下降是由mNK特异性引起的，并且很有可能是由细胞溶解造成的。mNK细胞能够引起NIH 3T3细胞的时间依赖性溶解，但YAC细胞没有该效果（图1B）。为了进一步证明细胞溶解效应，当细胞溶解达到50%时（添加mNK细胞后8小时），对靶细胞进行镜检。如图1C所示，mNK细胞通过细胞溶解作用很快将靶细胞有效地清理掉，而对照YAC细胞对靶细胞没有任何影响。

总之，使用xCELLigence系统是目前一种，不需要对靶细胞进行标记或添加任何化学指示物，就能够直接检测NK细胞介导的细胞溶解的方法。另外，该系统可以动态监测整个细胞溶解过程，这是利用基于标记的终点分析法所不能做到的。

图1：动态监测NK细胞介导的细胞溶解

（A） 动态监测 NK细胞介导的NIH3T3细胞溶解。96孔E-Plate板每孔中接种5000个NIH3T3细胞。实时监测细胞粘附，扩散和增殖。细胞接种后34小时，CI值为3，等同于每孔大约10000细胞。每孔加入150,000mNK细胞或YAC细胞（阴性对照），每组三重复孔。（B）mNK细胞的时间依赖性溶解活性。计算特定时刻的细胞溶解活性，用细胞溶解百分比表示{细胞溶解%=（CI_对照－CI_效应细胞）/CI_对照X 100}。（C）mNK细胞作用后的形态学观查。NIH 3T3细胞被mNK细胞特异性细胞溶解后，用Giemsa blue 染色后进行镜检。

定量检测NK细胞介导的细胞溶解

细胞指数与细胞数目有关⁵，已经被用于定量监测化学物质，如抗癌药引起的细胞毒性。为了检验mNK细胞的活性是否也可以定量分析，用不同比例的效应/靶细胞来检测细胞溶解。利用鼠和人的NK细胞（mNK和NK92）作为效应细胞，NIH 3T3细胞和MCF7细胞（人乳腺癌细胞）分别作为效应细胞的靶细胞。如前所述，96孔 E-Plate板每孔接种5000个靶细胞，并用阻抗系统监测细胞生长。当靶细胞达到生长期，直接加入不同浓度的NK细胞。监测不同E/T比的NK细胞介导的细胞溶解。

如图2所示，向靶细胞中加入mNK或NK92细胞后，与未加效应细胞的对照相比，细胞指数降低了。细胞指数的降低是依赖于E/T比的。细胞溶解过程中，细胞与电极相互作用的降低引起了细胞指数的降低。E/T越大，得到的细胞指数值越小。表明xCELLigence系统支持特异性NK细胞介导的细胞溶解活性的定量分析。而且，通过细胞溶解的动态监测，有助于更深入理解NK细胞介导的杀伤作用的潜在机理。例如对细胞溶解的动态分析，表明NK92细胞比mNK细胞的杀伤能力更强，E/T为4：1或更高时，加入NK92四小时内，90%的MCF7细胞都被溶解，而在相同的时间内加入mNK细胞只引起30%细胞溶解，NK细胞介导的细胞溶解动力学各不相同，表明效应细胞和靶细胞之间的相互作用，本质上是细胞特异性的，而且会有诸多因素的参与，如NK受体和配体的表达，或NK细胞介导的不同细胞溶解机制。

图2：无标记定量分析mNK 和NK92细胞的溶解活性。（A）mNK细胞溶解活性的定量分析。NIH 3T3细胞接种到96孔E-Plate板，使用xCELLigence 系统实时监测，直到CI值达到3，相当于每孔10,000个细胞。将不同浓度的mNK细胞以不同的E/T接种到靶细胞中，并动态监测细胞的溶解活性。利用归一化的细胞指数值表示，即加入mNK细胞得到的细胞指数值与同一孔加入mNK细胞前的细胞指数值的比 。（B） 不同E/T比下mNK的时间依赖性细胞溶解活性。mNK细胞介导的NIH 3T3的细胞溶解百分比的计算方法如图1。时间依赖性细胞溶解活性如图所示。（C）对NK92 细胞溶解活性的进行定量。接种MCF7靶细胞，xCELLigence系统监测细胞生长， NK92细胞以不同E/T比加入到靶细胞中，系统动态监测不同E/T比下的NK92细胞对MCF7的细胞溶解活性。（D）不同E/T比下的时间依赖性NK92细胞的溶解活性。NK92细胞对MCF7的细胞溶解百分比的计算方法如图1。

无标记分析NK细胞对多种靶细胞的细胞溶解活性

利用8种不同的人类癌细胞和NIH 3T3细胞作为靶细胞，测试mNK和NK92的细胞溶解活性，表1和2总结了mNK 和NK92介导的细胞溶解对不同靶细胞的敏感性。NK92对癌细胞具有广谱细胞溶解活性。加入NK92不到8小时就能够达到杀伤活性。图3A对比了NK92细胞对7种癌细胞的敏感性，其中四种靶细胞都出现超过90%的细胞溶解，包括H460, HepG2, Hela和MDA-MB231细胞。相反，mNK细胞介导的细胞溶解比NK92更具有选择性（图3B），参加测试的9种细胞中仅有4种（NIH3T3, A549, Hela, ａnd MDA-MB231）在加入mNK细胞后的12小时内，发生30%以上的溶解。OVCAR4, HT1080, HepG2, H460和MCF7五种细胞没有发生溶解，或只是微弱的溶解（10%）。另外，mNK介导的细胞溶解比NK92要慢得多，加入mNK12小时后才达到值。

综上所述，实验证明，基于阻抗的xCELLigence系统可以用于NK细胞介导的细胞溶解活性的分析，且无需任何标记。人和鼠的NK细胞被用来对9种靶细胞（包括通常使用的人癌细胞）进行了实验。该系统可以对NK细胞介导的细胞溶解进行动态定量分析，无需任何外源标记和额外试剂。而且这种全新的技术提供了全自动在线细胞溶解分析，可以用于大规模的筛选调节NK细胞介导的细胞溶解的化合物或基因。

图3：无标记分析NK细胞介导的多种细胞溶解（A）NK92细胞介导的7种癌细胞溶解。细胞溶解的百分比是通过加入NK92细胞8小时后 计算细胞指数值得到的；此刻细胞溶解达到。（B）mNK细胞介导9种不同细胞溶解。细胞溶解的百分比通过加入mNK后12小时的细胞指数值计算得到的，此时细胞溶解达到。

表1： mNK细胞介导的9种细胞溶解

表2：NK92细胞介导的7种细胞溶解

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