大鼠糖缺失性转铁蛋白试剂盒详细说明书

【注意事项】

1. 从-20℃取出的试剂盒，在4℃解冻过夜。盒内每一瓶解冻的溶液在开启瓶盖之前都要轻轻摇匀，避免解冻时出现的分层，否则会出现浓度不均一的现象。

2. 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。

3. 配制各种试剂时，切记混匀！

4. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

5. 建议所有猪IL-1β标准品、样本都做双份检测。

6. 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活！

7. 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

【洗板方法】

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

【样品的准备和保存】

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

血清——用干净试管收集血液，室温凝固2小时或4℃过夜，离心1000×g 10分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

【样品稀释的一般原则】

用户须查阅文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的*佳检测范围。样品的稀释应有详细记录。

【试剂准备和保存】

A. 猪IL-1β标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入1ml样品稀释液，彻底溶解后做倍比稀释。

稀释后的猪IL-1β标准品在2小时内使用。

B．生物素标记猪IL-1β抗体工作液：在使用前2小时内准备。

1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。

2． 按10ul生物素标记猪IL-1β抗体加猪IL-1β抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。

1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实配时应多配制0.1-0.2ml）。

2． 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

D. TMB显色工作液的准备：在使用之前30分钟，按TMB显色液A 9份加 TMB显色液B 1份的比例配制TMB显色工作液。

【大鼠糖缺失性转铁蛋白试剂盒操作程序】

1． 确定本次检测所需的已包被猪IL-1β抗体的酶标板孔数目。

2． 将倍比稀释的猪IL-1β标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。

3． 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。

4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。

5． 将准备好的生物素猪IL-1β抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。

6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。

7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。

8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。

9． 按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见猪IL-1β标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔。（显色反应*长不要超过30分钟）。

10． 用酶标仪在450nm测定O.D.值。

11． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

【操作程序总结】：

准备试剂，样品和猪IL-1β标准品

加入准备好的样品和猪IL-1β标准品，37℃反应90分钟

洗板2次，加入生物素化猪IL-1β抗体工作液，37℃反应60分钟

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟

洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应

加入TMB终止液

30分钟之内读OD值

计算标本待测因子含量

【检测范围】：1000pg/ml→15.6pg/ml。

【敏感性】： ＜5pg/ml

【特异性】： 系统和其它细胞因子无交叉反应。

【保存】： -20℃ [短期内（如两周）可4℃]

【有效期】： 12个月（-20℃）。

【大鼠糖缺失性转铁蛋白试剂盒用途】： 用于体外定量分析液体标本（通用型）。

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