（1）纯化法

在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片，通过悬浮在无钙镁的中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的（100 mg组织加入1ml ）。在4℃孵育6~18h，使几乎没有活性的酶尽可能渗透进去。移弃组织碎片中在37℃孵育包含残留的组织碎片20~30分钟。在组织碎片加入热的培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆抑制剂。

通过无菌不锈钢丝网（100~200 mm）过滤，分散所有剩余组织，计数和接种细胞，进行培养。

（2）胶原酶纯化法

用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用平衡液清洗组织碎片几次。加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在平衡液中）。在37℃孵育4~18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。通过离心在平衡液中清洗悬液几次。再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

（3）Dispase纯化法

用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用不含钙镁的清洗组织碎片几次。加入Dispase（0.6～2.4单位/ml溶解在无钙镁的）在37℃孵育20分钟~几个小时。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。通过离心在中清洗悬液几次，再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

分离细胞后，首-次传代需要注意的问题：

传代培养时先观察细胞的活性。细胞的活率应该超过90%，密度控制在80%左右

对于无血清培养基，需要降低使用量。

1. 移弃使用过的细胞培养基。

2.使用不包含有钙镁的或EDTA清洗细胞。在培养瓶背着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1~2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

3.加入消化，消化细胞与细胞，操作手法，试剂的效价有密切的关系，消化时应注意观察细胞形态，如细胞变得椭圆透亮，并且可以观察到细胞与细胞间的间隙时，轻拍瓶身可以看见成流沙状，即可中止消化，消化时尽量减少对细胞的吹打。

4.当细胞分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入培养基中止消化，计数并再次培养细胞。

5.对于无血清培养基，加入大豆抑制剂。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml抑制剂到中将抑制活性。

原创作者：上海劲马实验设备有限公司