小鼠核转录因子(NF-kB )ELISA试剂盒说明书

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗小鼠NF-kB单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的NF-kB与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠NF-kB ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，*后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，NF-kB 浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中NF-kB浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

酶标板（Coated Wells）	96孔	酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate）	12ml
10×标本稀释液（Sample Buffer）	12ml	20×浓缩洗涤液（Wash Buffer）	50ml
标准品（Standards）：10ng/瓶	2瓶	底物工作液（TMB Solution）	12ml
抗体工作液（Biotinylated Antibody）	12ml	终止液（Stop Solution）	12ml

准备试剂与收集血样

1. 收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。

2. 标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

标本激活方法

1. 将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。

2. 加20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60± 2分钟。

3. 加20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。

4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本NF-kB 的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）

5. 细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释（410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH）。

检测程序

1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3. 每孔中加入抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4. 洗板：同前。

5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

6. 洗板：同前。

7. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8. 每孔加入100ul终止液混匀。

9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2. 以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应NF-kB 含量，再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能

1. 灵敏度：*小的NF-kB检测浓度小于15pg/ml。

2. 特异性：可同时检测重组或天然的小鼠NF-kB 。不与小鼠其它细胞因子有交叉反应。

3. 重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。

注意事项

1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

4. 本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。

5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！

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