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石蜡切片免疫组化染色实验操作流程
点击次数：14709 发布时间：2021/1/18 13:54:49
1.石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色应置 60℃ 1 小时） 。
① 二甲苯 、II，各 10 分钟。
② 梯度酒精：100%，2 分钟 95%，2 分钟 80%，2 分钟 70% 2 分钟。
③ 蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。
2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2 O2 ，室温 10 分钟（避光） 。
3.蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床） 。
4.抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mMpH 6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制：① 储备液的配制：A 液：枸橼酸三钠- 2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml；B 液：枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml；② 工作液的配制：A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸馏水 900ml
抗原修复的方法：
① 高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽 3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高 压锅外冲，以助冷却） 。
② 微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸 钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的 枸橼酸钠缓冲液； 再选择中高或高档，5分钟（.*佳温度为 92 95℃）
③ 酶消化处理。
抗原修复的注意事项：① 组织不能干。 ② 选择抗原修复方法要因抗体而异。 ③ 该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④ 抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均需用 PBS 缓冲液。
5.PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。
6.正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 （保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清 （与第二抗 体 同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。
附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。
7.滴加抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加抗体，37℃ 2 小时（也可置于 4℃冰箱过夜） 。
8.PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。
9.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。
10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。
11．滴加三抗 （SAB 复合物） ，37℃，40 分钟。
12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。
13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止） 。
附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30 ，自来水冲洗。
16．自来水冲洗返蓝，15 分钟。
17．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。
18．二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分钟。
19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
原创作者：上海恒远生物技术发展有限公司
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