常见的染色方法包括简单染色、负染色、革兰氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、荚膜染色。制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤，然后用显微镜甚至油镜观察。

1.简单染色：

   不同细菌或由于观察者所侧重观察的内容不同，所使用的染料也有差异，但简单染色的方法是一样的。先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上的菌膜区域，以覆盖菌膜为准。按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时进行水洗，干燥等步骤。*后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。

2.负染色：

   制备观察图片是非常容易的，但对初学者来说想要在玻片中找到目标菌还是有一定难度的，因为细菌常常无色透明且较小，所以对初学者来说除非对光圈等进行很精细的调节，否则很难观察到目标菌，因此进行负染色就十分重要。该方法是将微生物与苯胺黑混合，再将混合物覆盖于载玻片表面，由于这两种天然黑色染料不能渗入微生物细胞，所以使得透明的微生物个体在黑色的背景下很容易观察。

负染色法常见有两种操作方法。

① 在一个载玻片上将微生物与异地苯胺黑混合，用另外的载玻片将混合物均匀的覆盖于原来的载玻片上。该方法的目的是使混合物在在玻片上一边厚一边薄，在厚与薄中间的额区域就是*佳观察区域。

② 用一接种环苯胺黑与微生物混合，用接种针在载玻片的中央将混合物延伸很小的区域。

3.革兰氏染色：

   革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不会脱去，有的可以被脱去，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为方便进一步观察，脱色后再用碱性蕃红进行复染，阳性菌仍为紫色，阴性菌染成红色，这就是革兰氏染色的原理。

其步骤包括初染、媒染、脱色、复染四个步骤。

4.芽孢染色法：

   部分细菌能产生内孢子，这些孢子能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。虽然芽孢在革兰氏染色片中可以看到，但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，便于观察。主要的芽孢染色法有孔雀绿染色法和石碳酸复红染色法。

5.鞭毛染色法：

   鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，超出了光学显微镜观察极限，因此通常情况在显微镜下观察不到。通过特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能在光学显微镜下观察到鞭毛。鞭毛染色一般分银盐法和复红沉淀法两种。

6.荚膜染色：

   一般细菌的荚膜与染色剂的亲和性低，但荚膜通透性高，因此染料可透过荚膜使菌体着色。一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨。

荚膜染色步骤：加一滴6%葡萄糖水溶液在载玻片的一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养72h左右的胶质芽孢杆菌与其混合，加1滴墨汁充分混匀，用推片法制片将菌液铺成薄层，自然干燥，滴加1-2滴无水乙醇覆盖涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗一次，使用擦镜纸擦干后即可镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。

染色法在细菌的观察、分类、鉴定中经常用到，因此是微生物检测人员不可或缺的基本技能。

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