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elisa细胞裂解液获取方法
elisa细胞裂解液获取方法
细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。通常我们都会想到用RIPA裂解液提取的蛋白做elisa，但是这个方法不太推荐，从提取蛋白自身的角度来考虑，RIPA裂解液可以使蛋白质的空间结构破坏，即破坏蛋白质分子的二级和三级结构，从而使抗原决定簇得以充分暴露在外，更有利于被检测出来；而从试剂盒本身的角度来考虑，以双抗体夹心法为例，提取的蛋白中含有RIPA裂解液，当加入到包被的孔板当中时，可能同样会对孔板中的包被的抗体起到了裂解作用（如SDS），从而使其失去该有的特异性，这方面可能需要考虑在内的。
下面我们推荐另外2种比较好的获取细胞裂解液中蛋白的方法：
1、 冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing ａnd thawing），。原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。如果需求的蛋白表达很低，我们可以用细胞裂解液作辅助，方法是先用裂解液室温裂解一小时，然后反复冻溶三次。一般可以裂解到8ug/ul。切记裂解细胞时不要加太多裂解液，而且避免过多的反复冻溶。
2、 超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。bead-beating也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高，但通常得到的dna片段较小。
3、 Western Blot方法，方法步骤主要以下：
1）一瓶细胞（100ml的瓶子），PBS洗2次，胰酶消化，加入10ml 培养液，制备成细胞悬液；
2）细胞悬液移入10ml离心管中，4。C，2500rpm，离心5min；
3）上清，加入预冷的PBS（即4。C存放的PBS）于离心管中，吹打，4。C，2500rpm，离心5min；弃上清，重复上述步骤一次；共洗细胞2次，充分洗掉培养液；
4）上清，加入200ul细胞裂解液（每1ml裂解液中加入10ulPMSF），置于冰上，裂解40min～1h；裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，以使蛋白充分裂解；
5）出离心管，于4。C，12000rpm，离心5min；
6）上清移入EP管中，-20。C保存，即可。
细胞裂解机制被广泛应用于各类的生物实验中。为达到*佳的实验结果，需要注意的是所有的实验步骤都需在四度以下进行，并且避免过多的反复冻融。而且整个实验过程中记得戴手套。
原创作者：上海诺渊实业有限公司
