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核酸杂交技术
点击次数：292 发布时间：2012/7/24 9:54:31
核酸杂交技术是较早的应用于病原微生物的检测技术。因其操作步骤比较烦琐，现在在动物检验检疫中应用较少，但是它是其他一些核酸检测技术的基础。它的基本步骤如下。
首先，制备一段寡核苷酸，其序列对应于被测病原微生物某段特异性核酸序列，在此寡核苷酸上进行适当的标记，作为检测用探针。
然后，从样品中提取核酸，对此核酸进行变性处理后固定在固相载体上，这些核酸变性处理后多数以单链的形式存在，因此它们能够利用碱基互补原理，结合并固定探针，由于借助探针上标记的物质可以了解到是否有探针，甚至有多少探针被固定上去，再由此推知样品中是否含有及甚至含有多少病原微生物。
上述是*常用的固相杂交大致过程，除此之外还有液相杂交以及用于研究的细胞内定位（原位）杂交模式。新近发展的核酸芯片技术实际上也是一类核酸杂交技术。
就固相杂交而言，又可分为斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交。斑点杂交是直接将标本点在固相载体上杂交，该法迅速简单，一次可检测大量标本；凝胶电泳印迹转移杂交是电泳技术和杂交技术结合的一种方法，根据杂交核酸的不同，又可分为Southern印迹法（检测DNA）及Northern印迹法（检测RNA）。传统的固相载体多应用硝酸纤维膜和尼龙膜，近年来发展的微孔板包被技术以微孔板为载体取得了良好的效果。
探针标记物有放射性核素与非放射性物质两种。放射性核素标记敏感性高，可检测出pg水平的核酸，但因不易长期保存，且存在放射性污染等问题，现已较少应用。非放射性物质常用的有生物素、地高辛等，非放射性探针安全、稳定、操作方便并且经济，但敏感性较低，近年来，由于杂交信号检测方法的改进，检测的敏感性得到了很大提高。
原创作者：上海一基生物科技有限公司
