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公司动态
利用分析试剂盒定量分析蛋白聚集体
使用蛋白聚集分析试剂盒定量分析蛋白聚集体——优化生物工艺研发的创新性产品
Wayne F. Patton, Ph.D.
Keywords: 聚集、生物工艺、蛋白疗法、生物治疗
蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。
蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法，可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。
近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品，可以准确地定量检测蛋白聚集，加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的ProteoStat® protein aggregation assay，可对蛋白检测方法进行优化。
在这篇文章中，使用已知浓度的聚集IgG标准品作为标准曲线，通过ProteoStat® protein aggregation assay/standards对IgG的聚集水平进行检测，集中分析了制药工业中常见的3种聚集形式。
热诱导聚集
机械诱导聚集
冷冻和反复冻融诱导聚集
材料和方法
Enzo Life Sciences 推出了ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards，利用荧光分子信号染料可特异性结合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可检测。
探针在溶液中是不发出荧光的，当与聚集蛋白的四级结构结合时会发出明亮的荧光。一旦聚集标准品发生重组，它们将含有0-12.5%的聚集蛋白，总蛋白浓度维持在1mg/ml。
通过粒子分析成像鉴定标准品发现90%的蛋白聚集体长度为2-10um，约9%的蛋白聚集体长度为10-20um，约0.7%的蛋白聚集体为长度大于20um。
Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader （BioTek Instruments） 可用于所有蛋白聚集分析。它的激发波长为500nm，发射波长为600nm，激发和发射狭缝宽度为9nm，便于检测ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激发单色器激发波长为435nm，发射波长为495nm，都在激发和发射狭缝宽度为9nm的条件下进行检测。
在相同情况下，ProtesStat染料的荧光强度比Thioflavin T染料高100倍。对于浓度为1.2 ug/ml的聚集体，ProteoStat染料的信噪比为12.8，而Thioflavin T染料的信噪比仅为1.2，表明ProteoStat染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。
正因为由此显著的优势，ProteoStat protein aggregation assay和ProteoStat protein aggregation standards通常能够共同用于各种常规形式的蛋白聚集检测。
监控热诱导聚集
当蛋白受到提高温度刺激会加速其聚集。羊lgG（4mg/mL）在各个时期都处于搅拌速度400rmp，100mM磷酸钠，pH7.2，温度60℃下。
在每个时间点，25ul lgG用于测量。首先样本在1x assay buffer中稀释4倍后，得到的蛋白*终浓度为1 mg/ml。在每个孔中加入98ul的检测蛋白和2ul的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。
同时，ProteoStat protein aggregation standards中含有稳定的、高质量的对照样本，用来做标准曲线。
如图1所示，使用ProteoStat染料检测羊lgG在热诱导下的聚集情况，生成的曲线表明不同阶段lgG蛋白聚集的情况。
在刚开始阶段蛋白聚集情况较少，接着观察到生长阶段聚集体开始形成，*后生长率降低直至变成0，表明蛋白单体已几乎消失，差不多完全形成聚集体。
结果
在96孔微板中检测比较ProteoStat和Thioflavin T染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊lgG（4.26 mg/ml）在pH2.7的盐酸水溶液中，80℃温度下孵育90分钟后会形成蛋白聚集体。
聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的，但总的lgG蛋白浓度仍然是60 ug/ml。在50 mM磷酸钾，pH 7，3uM ProteoStat 检测试剂或5uM Thioflavin T 染料中读数。这些浓度在以前做过预实验，已经确定是*优的浓度。
在蛋白和染料一起孵育15分钟后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader读数。所用的板为Greiner µClear® black, clear bottom 96-well microplates （Greiner Bio One）。
