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溶血空斑实验技术
点击次数:340 发布时间:2016/12/13
溶血空斑实验技术
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一﹑原理
溶血空斑实验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法,即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液,与一定量的SRBC结合,于37℃作用下,免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素,在补体的参与下,使抗体形成细胞周围的SRBC溶解,从而在每一个抗体形成细胞周围,形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞,空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑实验具有特异性高,筛选力强,可直接观察等优点,故可用做判定免疫功能的指标,观察免疫应答的动力学变化,并可进行抗体种类及亚类的研究。
目前有关溶血空斑实验的具体方法很多,现仅将琼脂平板溶血空斑实验的操作方法简介如下。
二﹑材料与试剂
1、材料
平皿(直径5.5cm ×1.5cm),温箱(37℃),水浴箱(45℃),离心机,显微镜及白细胞计数器,18g~25g昆明系小鼠等。
2、试剂
(1)SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液),用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次,每次2000r/min离心5min,*后取压积红细胞,悬于灭菌pH值7.2PBS(含Ca2+、Mg2+)中,使成为20%浓度,经细胞计数后,调整细胞浓度为2.00×109个/ml;
(2)0.1Mol/LpH值7.2PBS(含Ca2+、Mg2+);
(3)低层和顶层琼脂将抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成1.4%和0.7%两种浓度。将0.7%的琼脂分装小试管,每管1.5ml备用;
(4)DEAE-右旋糖酐分子量5万,用蒸馏水配成1%浓度备用;
(5)补体采集3只以上豚鼠血清,应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE-右旋糖酐,可采用原补体或做1:5稀释)。
三﹑操作方法
1、免疫脾细胞悬液的制备
(1)小鼠免疫每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRBC悬液0.2ml;
(2)脾细胞悬液的制备将免疫后第四天的小鼠拉颈处死,解剖取出脾脏,放入含含Ca2+、Mg2+冷的pH7.2的PBS中漂洗后,去掉结缔组织,加入适量的PBS,用弯头镊子挤压脾细胞,稍静置,吸上清液至离心管中,1500r/min离心5min,弃上清后,定量加入PBS,混匀,按白细胞计数法计算脾细胞数,*后用PBS调整细胞数至1.00×107个/ml,一般每只鼠脾脏细胞数为1×108~1.5×108。
2、倾注底层琼脂
将1.4%琼脂凝胶加热融化后,倾注于水平位置的平皿内,每皿2ml~3ml,凝固后,置37℃温箱,平皿反扣,开盖1h后备用。
3、顶层琼脂的制备
将0.7%的琼脂融化后,置于45℃恒温水浴箱中,依次加入以下试剂:
(1)2.00×109/mlSRBC悬液0.1ml;
(2)1%DEAE-右旋糖酐0.05ml;
(3)1.00×107/ml脾细胞悬液0.1ml。
迅速混匀后,倾注于已铺好底层琼脂的平皿内,使之均匀铺平凝固后,静置约15min,放37℃温育1h~1.5h。
4、加补体
从温箱中取出平皿,每皿加入1:30稀释的新鲜豚鼠血清1.5ml(如未加DEAE-右旋糖酐,则加原血清或1:5稀释的新鲜血清1.5ml),继续放37℃温箱中温育30min后取出,观察溶血空斑。也可在室温下放置1h,4℃冰箱过夜,翌日观察结果。如需保存,可加入用生理盐水或PBS配制的0.25%戊二醛6ml进行固定。
四、结果判定
观察时,将平皿对着光亮处,用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况,并记录整个平皿中的空斑数,同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。
五、注意事项
1、对SRBC的要求因为SRBC既是免疫原,也是靶细胞和指示细胞,故要求SRBC应新鲜,洗涤不超过3次,每次2000r/min离心5min,细胞变形或脆性增大者均不能使用。阿氏液保存的血液可用两周。
2、免疫所用SRBC的数量尾静脉注射以2.00×104个/0.2ml为宜。腹腔注射为4.00×108个/ml,用量小,如低于1.00×107个/ml注射0.5ml,空斑形成极少;用量过大,超过2.50×109个/ml,多不能形成空斑。
3、采取免疫脾的时间无论是经尾静脉还是腹腔免疫,均以免疫后第四天取脾为宜,过早或过晚空斑都形成极少。
4、脾细胞的活力为了保证脾细胞的活力,制备脾细胞过程中所用PBS(或Hank’s液),临用时方从4℃冰箱中取出,或整个操作过程应在冰浴中进行。
5、倾注平板的要求底层要平,上层要把握好温度。
6、补体的活力补体活力的大小,对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下,将不能形成空斑。所以补体要新鲜,并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。DEAE-右旋糖酐是一种多盐的水溶性物质,由于琼脂的半乳糖链上含有抗补体的硫酸酯基团,DEAE-右旋糖酐能与它形成不可置换的结合,而使之沉淀,从而消除琼脂的抗补体作用。
7、空斑计数要求判读准确,避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时,应镜检,对肉眼结果进行核对。